烟草黑胫病拮抗菌的筛选鉴定及其发酵工艺优化

张 涛，雷帮星，何 劲，文晓鹏

( 1．贵州大学 农业生物工程研究院/生命科学学院，贵州省生化工程中心，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵阳学院，贵州 贵阳 550005)

烟草黑胫病拮抗菌的筛选鉴定及其发酵工艺优化

张 涛1，雷帮星1，何 劲2*，文晓鹏1

( 1．贵州大学 农业生物工程研究院/生命科学学院，贵州省生化工程中心，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵阳学院，贵州 贵阳 550005)

【目的】为筛选出对烟草黑胫病具有拮抗作用的细菌菌株，为烟草黑胫病的生物防治及生物农药的开发提供理论依据。【方法】采用平板对峙法筛选对烟草黑胫病有明显抑制作用的细菌菌株，结合形态观察、生理生化特征及分子生物学特征对该菌株进行鉴定，并利用菌饼法对该菌株的培养工艺进行优化。【结果】筛选出的菌株D1为革兰氏阳性菌、短杆状、产孢，且生理生化特征及16S rRNA基因序列与解淀粉芽孢杆菌具有极高的相似性(97 %)，因此确认菌株D1为解淀粉芽孢杆菌。筛选的最优培养基为PD液体培养基，最优碳源为蔗糖、氮源为蛋白胨、无机盐为氯化钙，最优配比为蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %；最佳培养条件为pH 7～8、培养时间42 h和装瓶量30 %。【结论】筛选得到的目的菌株通过发酵培养对烟草黑胫病有明显的抑制作用，可作为生防菌开发利用。

烟草黑胫病；解淀粉芽孢杆菌；生物防治

【研究意义】烟草(Nicotianatabacum)是以收获叶片为主的重要经济作物，是世界上种植最广泛的非食用的叶用经济作物，同时，也是我国重要的经济作物之一。烟草黑胫病(Phytophthoranicotianae)是烟草常见病害，属藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、腐霉目(Pythiales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)，是世界烟草栽培中毁灭性的土传病害。烟草黑胫病发病率高、传染快、不易控制，在苗期和大田期均可发生，受染烟草整株死亡[1]。【前人研究进展】据不完全统计，我国烟草黑胫病平均每年发病面积高达76 373 hm2，产量损失近3×107kg，产值损失超过1.23亿元[2]。目前，对烟草黑胫病的防治措施以栽培管理、抗病品种及化学防治为主，常用的氨基甲酸酯类(Carbamtes)和羧酸酰胺类(Carboxylic acid amides)等是我国烟草黑胫病防治的主要药剂[3]。【本研究切入点】随着无公害农产品生产规模的逐步扩大，生物农药的研究和开发越来越受到人们关注。利用微生物的拮抗作用开发新生物农药已成为国内外研究的热点[4]，对烟草产业有重要意义。刘畅等[5]通过实验筛选得到1株哈茨木霉对烟草黑胫病有较好的拮抗效果，其抑菌率达84.34 %；马冠华等[6]分离得到内生菌Itb57，对黑胫病温室内防治效果为69.28 %，田间防治效果为61.25 %～72.49 %。【拟解决的关键问题】采用平板对峙法研究贵州省生化工程中心分离保存的具有抗菌作用的细菌菌株(D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2、H3)对烟草黑胫病的生物防治效果，以期为丰富烟草黑胫病生物防治的微生物资源及其生物农药的开发应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 拮抗菌株：D1、Hd13、He14、He41、Hd213、F2和H3等7株细菌菌株，由贵州省生化工程中心分离保存。病原菌株：烟草黑胫病菌(Phytophthoranicotianae)，购买于中国农业微生物菌种保藏中心。

1.1.2 主要培养基 PDA固体培养基、牛肉膏蛋白胨培养液、PD培养液、LB培养液、大米培养液和基础培养液。

1.2 试验方法

1.2.1 目的菌株的筛选 采用平板对峙法，在PDA平板中央接种5 mm烟草黑胫病菌菌块，同时在平板4个边点接目的菌株，每个处理3次重复，28 ℃恒温培养4～6 d后观察抑菌效果。

1.2.2 目的菌株的鉴定 ①菌株生理生化试验。根据文献[7]中对细菌的鉴定特征，对其进行生理生化鉴定。②细菌DNA提取。采用热裂解法提取细菌DNA。用接种环挑取1个单菌落接种到15 mL试管中(装液量为30 %)。置28 ℃、150 r/min振荡培养18 h后，取1.5 mL细菌培养液，置于1000 r/min室温离心1 min，取沉淀，用1 mL无菌水洗2次，1000 r/min离心1 min，取沉淀，加100 μl TE(pH 8.0)重悬细胞，98 ℃水浴10 min，冰上放置5 min，2000 r/min离心1 min，取上清液，即为细菌DNA，于-20 ℃保存待用。③16S rRNA基因序列的扩增。采用细菌通用引物27 F和1492 R对样品的16S rRNA基因序列进行PCR扩增，引物序列：27F 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR扩增体系25 μl：27 F和1492 R各0.5 μl，模析DNA 1 μl，ddH2O 10.5 μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl。PCR扩增条件：95 ℃ 5 min，循环1次；94 ℃ 1 min，循环30次；55 ℃ 1 min，循环30次；72 ℃ 1.5 min，循环30次；72 ℃ 10 min，循环1次；-20 ℃保存备用。④特异PCR法对菌株的鉴定。根据3种芽孢杆菌全基因组中β-甘露聚糖酶基因上下游设计3种特异性引物[8](表1)。特异PCR反应扩增体系：引物各0.5 μl，DNA 1 μl，2×Mix 5 μl，ddH2O 3 μl。特异PCR扩增反应条件：94 ℃ 5 min，循环1次；94 ℃ 30 s，循环35次；50 ℃ 30 s，循环35次；72 ℃ 1.5 min，循环35次；72 ℃ 1.5 min，循环35次；72 ℃ 10 min，循环1次；-20 ℃保存备用。

1.2.3 培养基的优化 ①单因素试验。培养基种类：选取1.1.2中5种不同培养液，28 ℃，120 r/min振荡培养培养7 d，采用菌饼法做抑菌活性试验，分析不同菌株培养液对抗烟草黑胫病菌抗菌活性的影响。碳源：分别以20 %的麦芽糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、D-木糖、D-果糖和甘油替代基础培养基中的碳源，28 ℃、120 r/min摇瓶培养7 d，比较不同碳源目的菌株抗烟草黑胫病菌活性的效果。氮源：在最佳碳源基础上，分别以10 %的NH4NO3、蛋白胨、(NH4)2SO4、脲素、CH3COO NH4、NaNO3和NH4Cl替代基础培养基中的氮源，28 ℃、120 r/min摇瓶培养7 d，比较不同氮源目的菌株抗烟草黑胫病菌活性的效果。无机盐：在最佳碳源和氮源基础上，选择MgSO4、柠檬酸钠、KH2PO4、K2HPO4、(NH4)2SO4和CaCl2无机盐离子，28 ℃、120 r/min摇瓶培养7 d，考察无机盐对目的菌株抗烟草黑胫病菌活性影响的因素及最佳的水平组合。②正交实验。根据单因素试验结果进行3因素3水平试验，具体因素及水平见表1。

1.2.4 发酵培养条件筛选 ①培养基初始pH。用浓度分别为10 % NaOH和10 % HCl的溶液将培养基初始pH调为3、4、5、6、7、8和9，以自然pH为对照，121 ℃灭菌30 mim。冷却后接种目的菌株，120 r/min摇瓶培养7 d，每个处理3次重复，计算抑菌率，筛选最优初始pH。②培养时间。分别取培养6、12、18、24、30、36、42、48和54 h的发酵液进行抑菌实验，每个处理3次重复，筛选最适培养时间。③培养温度。分别设置温度20、28、32和40 ℃，恒温培养7 d，考察菌株发酵液对烟草黑胫病菌活性的影响，每个处理3次重复，测量菌块直径，筛选最适培养温度。④装瓶量。用300 mL培养瓶分别以装瓶量为6 %、12 %、18 %、24 %、30 %、36 %和42 %接种目的菌株，120 r/min摇瓶培养7 d，每个处理3次重复，得到目的菌株摇床培养最优装瓶量。

表1 芽孢杆菌全基因组中β-甘露聚糖酶基因引物信息

表2 培养基正交试验因素及水平

1.3 统计分析

PCR扩增产物由北京赛诺基因有限公司完成测序，将所获得基因序列在NCBI网址上进行Blastn比对，利用Mega 5软件进行DNA序列排序，再用PAUP 4.0软件分析，以最大简约法(Maximum parsimony，MP)构建分子系统发育树。用Microsoft Excel 2007对所得原始试验数据进行整理，用SPSS 19.0进行数据处理，采用Duncan新复极差法进行单因素试验统计分析。

2 结果与分析

2.1 目的菌株的筛选

从图1看出，D1、Hd13、He14、He41、Hd213和H3等6株细菌菌株对烟草黑胫病菌均有一定的抑制作用，菌株F2对烟草黑胫病无抑制作用。抑制效果依次为D1>Hd213>Hd13>He14>He41>H3>F2，其中，以菌株D1的抑菌效果最为明显，形成的菌落能有效抑制烟草黑胫病菌饼的生长和菌丝形成。

a为Hd213，b为D1，c为Hd13，d为H3，e为He14，f为He41，g为F2，h为对照a.Hd213; b.D1; c.Hd13; d.H3; e.He14; f.He41; g.F2; h.CK图1 不同细菌菌株对烟草黑胫病的抑制效果Fig.1 Inhibition effect of different bacterial strains against P.nicotianae

a和b为菌落，c为革兰氏染色，d为芽孢染色a and b.Colony; c.Gram staining; d.Spore staining图2 菌株D1的菌落及显微结构Fig.2 The colony and microstructure of strain D1

2.2 目的菌株D1的鉴定

2.2.1 形态特征 LB平板上，菌落呈圆形，为乳白色，有透明胶状分泌物，中央凸起；28 ℃恒温培养72 h后表面略粗糙，边缘凸起；培养后期边缘产生不明显羽状分枝。革兰氏染色后于10×100光学显微镜下观察，目的菌株呈杆状，紫色；有芽孢，经芽孢染色可见，芽孢呈绿色椭圆形，菌体呈红色，初步鉴定为革兰氏阳性菌(图2)。

2.2.2 菌株D1生理生化及分子生物学特性 经生理生化试验，菌株D1的过氧化氢酶、水解淀粉、乙酰甲基甲醇、硝酸盐还原、D-葡萄糖和甘露醇等试验结果均表现阳性，结合《常见细菌系统鉴定手册》[7]，其生理生化特性与芽孢杆菌相符。

以菌株D1所提DNA为模板，用通用细菌引物(27F和1492R)进行PCR扩增，其目的条带大小约1300 bp(图3 A)，利用枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的特异引物进行特异PCR扩增，只有使用解淀粉芽孢杆菌特异引物能看条带，且扩增片段与通用引物PCR结果相对应(图3B)，在1300 bp左右。将PCR产物进行测序，将其序列提交GenBank得到登录号为GenBank KU761585。经NCBI比对及构建发育树，菌株D1与解淀粉芽孢杆菌(BacillusamyloliquefaciensHQ840645)具有97 %的相似性(图3C)，结合生理生化试验结果确认菌株D1为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

2.2.3 菌株发酵工艺优化 从图4看出，PD培养液为最优培养基，其抑菌率达62.27 %；牛肉膏蛋白胨培养液其次，抑菌率为56.25 %。以PD培养液为基础培养基，6种碳源培养液均能对烟草黑胫病菌产生抑制作用，其中蔗糖为最优碳源，其抑菌率达66.53 %。以蔗糖为最优碳源条件下，以蛋白胨为氮源的抑制效果最好，其抑菌率达69.36 %。不同无机盐的培养基对烟草黑胫病均有明显的抑制作用，其中以CaCl2的效果最好，其抑菌率达68.46 %。

从表3看出，3个因素对菌株D1抗烟草黑胫病菌的抑菌率活性影响为蔗糖>CaCl2>蛋白胨，其中蔗糖浓度对抗性显著性(F=24.3>F0.05=19)影响。结合各影响因素得菌株D1抗烟草黑胫病的活性最优培养基配方为蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %。

2.2.4 培养条件的优化 从图5看出，初始pH、培养时间、培养温度和装瓶量均对菌株D1发酵滤液抗烟草黑胫病菌活性有影响。

A为PCR 电泳图，B为特异PCR电泳图，C为16S rDNA序列构建的系统发育树，M为DNAmarkerA.PCR electrophoretogram; B.Specific PCR electrophoretogram; C.Phylogenetic tree for 16S rDNA sequence; M.DNA marker图3 菌株D1的分子生物学鉴定结果Fig.3 Molecular biological identification of D1 strain

图4 不同影响因子对发酵菌株D1的抑菌率Fig.4 Effect of different influencing factors on inhibition ratio of D1 strain against P.nicotianae

(1)初始pH。 pH 3～6(酸性条件)时抑制效果较差，7～9(中性或弱碱条件)时抑制效果较好，其中以pH 7.6(自然)对烟草黑胫病的抑制作用最好，因此以pH 7～8为解淀粉芽孢杆菌D1的初始pH。

(2)培养时间。随着发酵时间延长培养液对烟草黑胫病的抑菌率呈先上升后下降趋势，到42、48 h具有显著的抑菌作用，54 h后抑菌活性下降。原因是发酵时间短，其生长周期不够，处于迟缓期，产生的活性物质较少，抑制效果较低；发酵时间长，由于底物浓度降低或细菌生长到衰亡期，所产活性物质减少，因此选取42 h作为最佳培养时间。

(3)培养温度。当温度为28 ℃时抑制效果最好，抑菌率达72.66 %；40 ℃时抑菌活性明显降低。表明，温度偏高不利于菌株生长，也不利于其抑菌活性物质的产生，因此选择28 ℃为菌株D1的最佳发酵温度。

(4)装瓶量。不同装量对菌株D1发酵滤液抗烟草黑胫病菌活性的影响不显著，其中以300 mL培养瓶装瓶30 %的效果最好。

3 讨 论

烟草黑胫病的病原菌为烟草疫霉菌，最早由VAN Breda de Haan 于1896年在印度尼西亚发现，20世纪20年代开始在美国发现，并迅速流行。我国烟草黑胫病分布范围广，福建发病率最高，此外，广西、湖南、四川、贵州、云南等烟草产区发生较为普遍[9]。烟草黑胫病菌菌丝最适生长温度为28～32 ℃，4 ℃时可存活2个月，其孢子可在不良环境中存活3年以上，在烟株残余组织上腐生时间在2年以上[10]。

本研究筛选得到对烟草黑胫病有拮抗作用的菌株D1为解淀粉芽孢杆菌。解淀粉芽孢杆菌为革兰氏阳性细菌，其抗逆性强，快速繁殖，在短时间内可在有限的空间和营养竞争中占据优势，有效抑制病原菌的侵染；解淀粉芽孢杆菌主要通过分泌聚酮类、多肽类、脂肽类及抗菌蛋白等多种抗菌物质，对病原菌起抑制作用[11]。胡忠亮等[12]概述了解淀粉芽孢杆菌在农业生产和环境保护上的应用，并指出解淀粉芽孢杆菌具有分布广泛、对人畜无害和不污染环境等优点而成为生防菌的重要研究对象。

表3 菌株D1培养基的正交试验结果

图5 不同条件下菌株D1发酵滤液对烟草黑胫病菌的影响Fig.5 Inhibition effect of strain D1 fermented filtrated liquor on P.nicotianae under different culture conditions

菌株D1的最优培养基为PD液体培养基，最优碳源为蔗糖、氮源为蛋白胨、无机盐为CaCl2，最优配比为蔗糖20 %、蛋白胨10 %和10 % CaCl2，最优发酵条件为初始pH 7～8、培养时间42 h、温度28 ℃和装瓶量30 %。与洪鹏等[13]对解淀粉芽孢杆菌HF-01发酵条件的优化结果存在差异，可能是菌株来源不同所致。

在生物防治中解淀粉芽孢杆菌已成为研究热点的生防菌株，通过对菌株发酵工艺的优化，使其处于最佳代谢期，产生较多抗菌活性物质。本研究只是在摇床条件下对菌株D1 发酵培养基的类型、成分及其培养条件进行了优化，今后还需进行小试、中试，以验证和完善发酵工艺，获得适合发酵罐的发酵工艺，在实际工业化生产中对发酵条件的控制方法还有待进一步深入研究。

4 结 论

本研究筛选到对烟草黑胫病有拮抗作用的菌株D1，其形态观察、生理生化特征与解淀粉芽孢杆菌相似，分子生物学鉴定结果显示菌株D1与解淀粉芽孢杆菌菌株B.amyloliquefaciensHQ840645具有97 %的序列同源性，并经分子生物学鉴定，确定拮抗细菌菌株D1为解淀粉芽孢杆菌。菌株D1发酵的最优培养基为PD液体培养基，最优碳源为蔗糖、氮源为蛋白胨、无机盐为CaCl2，最优配比为蔗糖20 %、蛋白胨10 %和CaCl210 %，最优发酵条件为初始pH 7～8、培养时间42 h、温度28 ℃和装瓶量30 %(100 mL/300 mL)。

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ScreeningandIdentificationofAntagonisticStrainsagainstPhytophthoranicotianaeandItsFermentationProcessOptimization

ZHANG Tao1，LEI Bang-xing1，HE Jin2*，WEN Xiao-peng1

(1.Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education)，Guizhou Center for Biochemical Engineering，Institute of Agro-bioengineering/College of Life Sciences，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China; 2.Guiyang University，Guizhou Guiyang 550005，China)

【Objective】 The study aimed to screen bacterial strains with an antagonism againstPhytophthoranicotianaeand to provide the theoretical basis for biological control and bio-pesticide development ofPhytophthoranicotianae.【Method】The bacterial strains with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaewere screened by the plate confrontation culture method. The screened strain was identified by morphological observation, physiological and biochemical property, and biological characteristics. The culture process of the screened strain was optimized.【Result】The screened D1 strain was a Gram-positive bacterium with a short bacilliform and spore-production. The similarity in physiological and biochemical property and 16S rRNA gene sequence between D1 stain andBacillusamyloliquefacienswas up to 97 %, which indicated that D1 strain wasBacillusamyloliquefaciens. The optimum medium for strain screening was PD + 20 g/L sucrose + 10 g/L peptone + 10 g/L CaCl2.The optimum culture conditions include pH 7-8, 42 hours and 30 % medium volume (100mL/300mL).【Conclusion】D1 strain with an obvious inhibition effect againstPhytophthoranicotianaecan be used for development and utilization of biological control bacteria.

Phytophthoranicotianae;Bacillusamyloliquefaciens; Biological control

1001-4829(2017)12-2717-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.017

2017-08-01

中国烟草公司贵州分公司技术开发项目“烟草白粉病生物防治及其田间关键配套技术”[(2014)2]

张 涛(1990-)，女，贵州遵义人，硕士，主要研究方向：发酵工程，E-mail:420636545@qq.com，Tel：18798009305，*为通讯作者：何 劲，E-mail:jhe633@163.com

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(责任编辑冯 卫)