金堂黑山羊FSH信号调节对下丘脑基因表达谱的影响

曹 冶，赵素君，谢 晶，王秋实，廖党金

(1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

金堂黑山羊FSH信号调节对下丘脑基因表达谱的影响

曹 冶1,2，赵素君1,2，谢 晶1, 2，王秋实1,2，廖党金1,2

(1.四川省畜牧科学研究院，四川 成都 610066；2.动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

【目的】本研究旨在搞清楚金堂黑山羊FSH信号调节机制的作用模式。【方法】将10只生殖周期相同的健康空怀的金堂黑山羊成年母羊随机分成2组，一组为对照组，一组为试验组。在发情后的第2天对试验组金堂黑山羊进行FSH肌肉注射100IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的下丘脑；对照组发情后的第3天摘取下丘脑，分别提取他们的总RNA，进行表达谱测序。【结果】经测序分析：对照组和试验组分别得到有效序列26004442和25041098条;经统计分析后，得到归一化序列25338808和24413890条，与山羊基因组的符合率分别达85.31 %和85.32 %。比对后发现152个基因出现显著性差异表达，其中117个基因上调了表达，35个基因下调了表达。GO功能分类发现1个生物学过程出现了显著性差异。KEGG功能分类没发现调节途径发生了显著性改变。结果显示FSH信号通过负反馈调节的方式对下丘脑进行调节，除了少量的基因表达随着FSH信号强度的变化外，其主要的生物学过程，调节途径均无显著性变化，这说明FSH信号的负向调节要轻微很多。【结论】FSH信号通过负反馈调节的方式对下丘脑进行调节，相比正向调节，FSH信号的负向调节要轻微很多。

金堂黑山羊；FSH信号；下丘脑；基因表达谱

【研究意义】金堂黑山羊属我国优良的地方黑山羊品种。它们的繁殖力显著高于其他一些山羊品种，据报道金堂黑山羊的产羔数达2.40，大大高于世界上其它优秀山羊品种(波尔山羊2.00，南江黄羊2.10)[1]。动物繁殖力与FSH信号通路紧密相关，搞清楚金堂黑山羊FSH信号通路的调节机制，对合理利用其高繁殖性能具有极其重要的意义。【前人研究进展】在前期研究中，发现金堂黑山羊的繁殖器官中有2条FSHR同时表达，通过形成异源二聚体显著增加了FSH信号强度，促进了排卵，从而形成高繁殖力。基于以上研究，我们发现动物高繁殖力的主要控制因素在于FSH信号通路。然而FSH是由脑垂体分泌的激素，经血液循环进入靶器官，进行生殖调节，在此过程中，会受到较多的因素(如FSH剂量、FSH受体表达、FSH与受体结合，结合后下游因子作用等)影响，这些因素叠加起来进一步影响动物排卵。以上发现表明动物对FSH信号通路的调节存在着一定的调节机制，可能是受研究手段的限制，到目前为止，尚未见报道。下丘脑是动物性腺轴的重要一环，它通过释放促性腺释放激素来启动动物垂体分泌垂体激素，垂体激素作用于性腺启动排卵机制，同时启动性腺分泌性激素来优化生殖内环境，从而启动动物生殖，性腺轴不仅正向调节动物排卵，同时也负反馈调节上游激素的分泌等[2-3]，到目前其负反馈调节机制并不明朗。【本研究切入点】本研究通过改变金堂黑山羊的FSH信号强度，来测定下丘脑基因表达谱的变化。【拟解决的关键问题】通过本次研究为彻底搞清楚FSH信号的调节机制打下坚实基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

在金堂黑山羊原种场随机选取年龄在3～5岁，体重30～40 kg，营养良好、前3胎产仔数在2个以上的健康空怀的金堂黑山羊成年母羊10只作为试验用羊，供试羊在栏内散放饲养，自由采食、饮水。实验前，观察发情情况，连续观察30 d。

1.2 主要试剂

Trizol为Invetrogen公司(美国)产品，FSH购自于宁波激素一厂，化学试剂除注明外，均为国产分析纯。

1.3 FSH处理

将10只试验用羊随机分成2组，每组5只羊。一组为对照组，不进行FSH注射。另一组为试验组。在发情后的第2天对试验组金堂黑山羊进行FSH肌肉注射，注射剂量为100 IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的卵巢。同时在对照组发情后的第3天摘取卵巢。卵巢液氮速冻后在-80 ℃条件下保存，用于基因表达谱分析。

1.4 总 RNA 提取

用Trizol试剂提取卵巢总RNA。提取步骤按照操作说明进行。将提取的卵巢总RNA送上海美吉生物有限公司进行表达谱测序分析。将得到的数据进行质控分析，包括A/T/G/C碱基含量分布统计、碱基质量分布分析、饱和度分析、冗余序列分析以及基因覆盖度分析，从而确定表达谱测序分析的质量。

1.5 GO(Gene Ontology)功能分类和KEGG PATHWAY代谢途径分析

将测得的基因表达谱用软件Goatools (https://github.com/tanghaibao/GOatools) 进行GO功能富集分析，使用Fisher精确检验。为控制计算的假阳性率，使用多重检验方法(Bonferroni)对P值进行了校正，通常情况下，当经过校正的P值(P_fdr)≤0.05时，认为此GO功能存在显著富集情况[4]。

将测得的基因表达谱用KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do ) 进行KEGG PATHWAY 富集分析,使用Fisher 精确检验进行计算。为控制计算假阳性率，采用BH(FDR) 方法进行多重检验，经过校正的P值(Corrected P-Value)以0.05 为阈值，满足此条件的KEGG 通路定义为在差异表达基因中显著富集的KEGG 通路[5]。

2 结果与分析

2.1 基因表达

本研究采用RNA-seq技术对2组经不同FSH处理的金堂黑山羊下丘脑样品进行表达谱测序(表1)。

分别得到有效序列26004442，25041098条。经统计分析后，得到归一化序列30216946，27124882条。将这些数据进行A/T/G/C碱基含量分布统计，发现该文库碱基分布均匀，模糊碱基N %在合理范围之内。同时，进行碱基质量分布统计，通过公式计算，可以得出一个综合的值，即质量值(Q)，用来评估测序的质量好坏，结果见表1，发现所获得测序数据达到后续分析要求。碱基错误率分布统计分析发现数据的碱基错误率均可以达到低于0.1 %。经统计分析后，得到归一化序列25338808和24413890条。

将质控后得到的高质量测序序列使用(http://tophat.cbcb.umd.edu/)与指定的参考基因组比对，参考基因组来自于http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/10731，如表2所示，发现符合率分别达85.31 %，85.32 %。

饱和度分析显示饱和度总体质量较高，该测序量能够覆盖绝大多数的表达基因。冗余序列分析显示此样本冗余序列含量正常。基因覆盖度分析显示结果不具有偏向性，结果较均一。

表1 测序数据统计结果

表2 与参考基因组比对结果

表3 金堂黑山羊下丘脑差异表达基因的GO功能分类

2.2 表达差异分析

将这些序列进行比对后发现，对照组金堂黑山羊152个基因出现显著性差异表达。其中117个基因上调了表达，35个基因下调了表达。其中，gene44399(transthyretin[Capra hircus])上调表达最高，上调了86.98倍。gene32112(ubiquitin-like protein ISG15)下调表达最多，下调了15倍。

2.3 差异表达基因的GO功能分类以及KEGG功能分类

表3对这些差异表达基因进行GO功能分类，发现1个生物学过程出现了显著性差异(P<0.05)，为器官形态变化(GO: 0009887)。

对这些差异表达基因进行KEGG功能分类，发现调节途径并未发生显著性改变。

3 讨 论

金堂黑山羊是一个优秀的地方山羊品种，具有生长发育快，体格大，特别是其繁殖力明显高于其它山羊品种。山羊是季节性发情动物，分别于春季和秋季发情。只有在发情期，山羊才会启动卵泡发育。已有研究表明：山羊发情后在1个发情期后出现3～4个卵泡波，第1个FSH卵泡波峰值出现在发情后的第1～5天。张超等[5]研究了不同繁殖力山羊血浆中FSH的分泌规律，发现大足黑山羊在1个发情周期出现3个卵泡波，第1个卵泡波FSH峰值出现在第2天，为8.422 IU/L，而莎能奶山羊在1个发情期有4个卵泡波，第1个卵泡波FSH峰值出现在第1天，为6.227 IU/L。葛世豪等[7]研究了济宁青山羊的FSH分泌规律，发现济宁青山羊在1个发情有4个卵泡波，第1个卵泡波FSH峰值出现在第2天，为3.63 IU/L。侯衍猛等[8]研究了莱芜黑山羊的FSH分泌规律，发现莱芜黑山羊在1个发情有4个卵泡波，第1个卵泡波FSH峰值出现在第5天，为0.70 IU/L。综上所述，可以确定山羊在发情后第1～5天，将出现第1个卵泡波FSH峰，峰值为0.7～8.4 IU/L。本次研究中，在发情后的第2天对试验验组金堂黑山羊进行FSH注射，提高金堂黑山羊的FSH信号强度。按照宁波激素一厂的产品说明，山羊超数排卵为间隔12 h连续4 d肌注FSH，总量为200～250 IU，平均每次注射60～80 IU。为此，选择1次注射，注射剂量为100 IU，并在注射24 h后，摘取金堂黑山羊的丘脑，检测FSH信号不同强度调节后，丘脑表达谱出现的差异。

甲状腺素结合蛋白(transthyretin)是大量存在于脑脊液的一种蛋白，它的主要功能是转运甲状腺素等激素[9]。Rojdmark等[10]推测甲状腺激素作用于下丘脑，通过刺激GnRH的分泌来间接影响促性腺激素的分泌；Erfurth等[11]进一步发现，甲状腺激素可通过作用于下丘脑的多巴胺能神经元来影响促性腺激素的分泌。在本次研究中，发现在下丘脑中甲状腺激素结合蛋白基因的上调表达，这可能是由于试验组FSH剂量的显著提高，必将通过负反馈来抑制促性腺激素的进一步分泌，而甲状腺素就是这样一个良好的调节剂，高表达的甲状腺素结合蛋白携带大量的甲状腺素在下丘脑中抑制了FSH的继续分泌，这也是FSH信号通路的一种负反馈调节方式，这与Rojdmark，Erfurth的观察一致。

干扰素刺激基因15(ISG15)是本次研究中下调表达最多的基因。该基因最早发现于牛和人的细胞中，是泛素小分子的一种，它以共价的方式链接在细胞膜和核仁蛋白上，影响分子结合[12]。Cohen等[13]发现泛素化过程作用于细胞表面的FSHR残基，从而调节FSH信号传导，Fang等[4]，Han等[15]发现到泛素化过程也可作用在与FSH信号传导相关的小蛋白分子上，从而影响FSH信号传导。本次研究中试验组ISG15的下调表达可能是通过减少下丘脑中的FSH信号传导相关蛋白的泛素化，从而减弱高剂量FSH的信号传导，从而调节FSH信号通路，这与上述的观察一致。

在本次研究中发现，试验组与对照组的GO功能分类显示只有1个生物学过程出现了显著性差异，那就是器官形态变化，而KEGG功能分类结果表明没有任何调节途径出现显著性差异。这可能是由于在哺乳动物中，FSH是由垂体分泌，最终作用于卵巢，刺激原始卵母细胞的征集、分化等过程。而下丘脑是性轴中通过释放促性腺释放激素来调节垂体分泌FSH等激素，是调节FSH分泌量的器官。那么不同强度的FSH信号对于下丘脑来说就是一种负反馈调节。相对于作用于卵巢的正向调节来说，负向调节就显得轻微许多。所以在本次研究中只出现了器官形态变化的显著性差异。

综上所述，FSH信号通过负反馈调节的方式对下丘脑进行调节，除了少量的基因表达随着FSH信号强度的变化外，其主要的生物学过程，调节途径均无显著性变化。这说明FSH信号的负向调节要轻微很多。

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EffectofFSHSignalRegulationonGeneExpressionProfilingofHypothalamusinJintangBlackGoat

CAO Ye1,2，ZHAO Su-jun1,2，XIE Jing1,2，WANG Qiu-shi1,2，LIAO Dang-jin1,2

(1. Sichuan Animal Science Academy, Sichuan Chengdu 610066, China; 2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Chengdu 610066, China)

【Objective】The purpose of this study was to understand the model of FSH signal regulation mechanism in Jintang black goat.【Method】10 healthy adult Jintang black goats in the same reproductive cycle were randomly divided into two groups, one was as control group, and the other is as tested group. On the second day of the estrus, Jintang black goats of tested group were injected with FSH 100IU, and their Hypothalamus were obtained in 24 hours after injection. On the third days of the estrus, the Hypothalamus of control group was obtained. Total RNAs were extracted, and the expression profiles were sequenced. 【Result】The effective sequences obtained from control group and tested group by sequencing analysis were 26004442 and 25041098, respectively; The normalized sequences by statistical analysis were 25338808, 24413890, and the coincidence rate of goat genome were 85.31 % and 85.32 %, respectively. After comparison, 152 genes were found to be significantly different, of which 117 genes were up-regulated, and 35 genes was down-regulated. GO functional classification reveals that the significant differences were founded in 1 biological process, and no significant difference was found in KEGG functional classification. The results indicated that the FSH signal regulate the hypothalamus by negative feedback regulation, and there was no significant change in the main biological process by FSH signal intensity change except for a small number of gene expression, which indicated that the negative regulation of FSH signal was slight. 【Conclusion】The FSH signal regulates the hypothalamus by feedback and is much less than that of the forward regulation.

Jintang black goat；FSH signal；Hypothalamus；Gene expression profiling

1001-4829(2017)12-2820-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.034

2017-05-02

四川省应用基础研究项目“金堂黑山羊FSH信号通路调节机制的研究”(2015JY0008)

曹 冶(1970-)，男，四川蓬安人，博士，研究员，现从事动物分子遗传研究，E-mail:cy3831@163.com。

S827

A

(责任编辑陈 虹)