肉鸡MSMO1基因的克隆及表达模式分析

徐凤华，宋 琪，邢晋祎，孙炜涵

(临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276005)

肉鸡MSMO1基因的克隆及表达模式分析

徐凤华，宋 琪，邢晋祎*，孙炜涵

(临沂大学生命科学学院，山东 临沂 276005)

【目的】克隆肉鸡MSMO1(Methylsterol monooxygenase 1)基因序列，并分析其表达模式，为研究MSMO1基因的功能奠定基础。 【方法】利用RT-PCR技术克隆肉鸡MSMO1基因，采用生物信息学方法分析其蛋白质结构，并用定量PCR技术检测MSMO1基因在组织间的表达差异。【结果】肉鸡MSMO1基因的cDNA序列长度为1404 bp，编码296个氨基酸；MSMO1蛋白145～274 位氨基酸序列残基存在FA-hydroxylase结构域，为亲水蛋白。进化树分析表明，肉鸡MSMO1氨基酸序列与日本鹌鹑和鹦鹉的MSMO1分子亲缘关系较近；二级结构主要以α-螺旋(41.89 %)为主。组织表达水平结果显示，在8种组织中均检测到MSMO1基因的表达，且在肝脏中的表达水平极显著高于其它7种组织中的表达水平(P<0.01)，在脾脏和胸肌中的表达水平极显著低于在肺脏和肝脏中的表达水平(P<0.01)。【结论】本结果将为进一步研究MSMO1基因的结构和功能奠定基础。

肉鸡；MSMO1基因；克隆；表达模式

【研究意义】甲基固醇单加氧酶1(Methylsterol monooxygenase 1，MSMO1)，又名固醇-C4-甲基氧化酶样基因(sterol-C4-methyloxidase-like，SC4MOL)，MSMO1基因突变能引起银屑病样尿布皮炎、关节痛、先天性白内障和发育迟缓等病人的常染色体隐性综合症，该基因编码固醇-C4-甲基氧化酶蛋白(sterol-C4-methyl oxidase)，定位在内质网膜上，在胆固醇生物合成途径中催化C4-甲基固醇去甲基化[1-3]。因此，MSMO1基因通过调节人体能量代谢、肥胖和血脂异常，从而在脂类的生物合成中起着关键作用[4-6]，而且对细胞的增殖和免疫调节起着调控作用[1]。【前人研究进展】目前，人MSMO1基因被定位在4q32-q34[7]，对MSMO1基因的研究主要集中在人类胆固醇合成和脂肪代谢方面，在畜禽方面的研究尚未见报道，尽管在GenBank数据库上已有原鸡的MSMO1基因序列，但肉鸡作为易于积累脂肪的动物，其MSMO1基因功能和结构尚不明了。【本研究切入点】本研究以肉鸡为研究对象，克隆MSMOS1基因序列，分析MSMOS1基因序列特征及表达谱。【拟解决的关键问题】研究结果可为进一步研究肉鸡MSMO1基因的结构和功能奠定基础。

表1 PCR引物序列和参数

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

随机挑选外形体貌和体重相近的42日龄肉鸡5只。屠宰前使其空腹12 h，自由饮水。屠宰后采集胸肌、腿肌、肾脏、心脏、脾脏、肺脏、腹脂和肝脏，切割成0.5～1.0 g小块，液氮速冻，-80 ℃保存，用于后续提取RNA。

1.2 主要仪器设备

高速冷冻离心机(Eppendorf)、凝胶成像系统、微量移液器(Eppendorf)、定量PCR仪(Roche)、高低温振荡培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统、超低温冰箱、超纯水机等。

1.3 主要试剂

Trizol Reagent和RNase Inhibitor(Invitrogen公司)、M-MLV反转录酶(Promega公司)、pMD19-T vector、LATaq聚合酶、EcoRⅠ、HindⅢ限制性内切酶、SYBR®Premix ExTaqTMII(宝生物工程(大连)有限公司)。

1.4 总RNA提取和cDNA合成

利用Trizol提取总RNA，并检测RNA的质量。用Promega公司的M-MLV反转录试剂盒制备cDNA。

1.5 鸡MSMO1基因的PCR扩增和测序

依据GeneBank上公布的原鸡MSMO1(NM_001006438)基因序列，用软件Primer premier 6.0设计引物MSMO1-f和MSMO1-r(表1)。以cDNA为模板，按照如下反应体系进行PCR扩增：10×PCR反应缓冲液(Mg2+plus)2.5 μl、模版cDNA 1.0 μl(约50～100 ng)、4种dNTP 混合物(每种2.5 mmol/L) 2.0 μl、上下游引物 (20 μmol/μl) 各0.5 μl、LATaq聚合酶0.2 μl (1 unit)、灭菌水加至25 μl，混合后稍离心。PCR反应程序：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 30 s；55 ℃ 退火 30 s；72 ℃延伸 50 s；72 ℃延伸5 min。

把PCR产物进行纯化回收。将pMD19-T vector与回收的PCR产物相连接，4 ℃放置过夜。制备感受态细胞，然后挑取平板上白斑单菌落，放置于含有3 mL LB培养液，3 μl Amp(质量浓度为100 μg/mL)的试管中，37 ℃恒温摇床培养过夜，提取质粒。用Hind Ⅲ和EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆，由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.6 MSMO1基因的生物信息学分析

将测序获得的序列用 NCBI的ORF Finder程序分析MSMO1基因的开放阅读框，预测氨基酸序列，用DNAMAN软件比较与其它动物MSMO1的氨基酸序列一致性；采用Blast程序分析其蛋白保守结构域；用软件MEGA 7.0构建进化树。利用ExPASy服务器上SOSUI程序进行疏水性分析，用SOPMA程序和SWISS-MODEL工具预测鸡MSMO1蛋白二级和三级结构。

1.7 MSMO1基因mRNA在不同组织中的表达模式

以胸肌、腿肌、肾脏、心脏、脾脏、肺脏、腹脂和肝脏组织的cDNA为模板，以Ex-f和Ex-r为引物(表1)，β-actin(GenBank: NM_205518)作内参，SYBR GreenⅠ为染料，利用real time PCR(qPCR)进行基因表达模式研究。qPCR反应体系： cDNA(稀释10倍)1 μl，SYBR®Premix ExTaqTMII 10 μl，上下游引物各0.2 μl, 40个循环；3个样本重复。用公式2-△△ct计算MSMO1基因的相对表达量。采用dps7.05软件对MSMO1基因的相对表达量进行多重比较统计分析。

2 结果与分析

表2 不同动物MSMO1基因序列比较

2.1 MSMO1基因克隆和序列分析

利用肉鸡肝脏cDNA为模板，以引物MSMO1-f和MSMO1-r扩增出1条特异带，经测序和结果分析表明，所扩增的肉鸡MSMO1基因序列长度为1 404 bp(图1)，开放阅读框为891 bp， 编码296个氨基酸。克隆的序列与GenBank上登录的序列一致性为99.57 %，仅有6 bp差异，氨基酸一致性为100 %，说明所克隆的序列为肉鸡的MSMO1基因序列。所克隆的肉鸡MSMO1基因核苷酸和氨基酸序列与其它物种比较，与日本鹌鹑和鸿雁的一致性较高，与大鼠和斑马鱼的一致性较低(表2)。由此推测，MSMO1蛋白在同类物种之间保守性较高。利用软件MEGA7.0构建鸡MSMO1氨基酸序列与其它物种的遗传进化树。从图2可见，鸡与鹦鹉和日本鹌鹑的MSMO1遗传关系比较近。

M：DL2000 DNA marker；1～4泳道：MSMO1基因扩增产物M: DL2000 DNA marker; 1-4 lane: PCR amplification products of MSMO1, respectively图1 鸡MSMO1基因PCR产物Fig.1 PCR products of broiler MSMO1

2.2 MSMO1蛋白保守域和结构分析

2.2.1 鸡MSMO1保守域分析 用Blast程序分析MSMOS1蛋白保守结构域。结果表明，肉鸡MSMO1的145～274 位氨基酸序列残基存在FA-hydroxylase结构域(图3)。

0.02代表遗传距离，每个节点的数字表示1000次重复后的靴带百分比0.02 represents genetic distance, and the number at each node indicates the percentage of bootstrapping after 1000 replications图2 鸡MSMO1氨基酸与其它动物氨基酸序列进化树Fig.2 Phylogenetic tree of MSMO1 with other animals was constructed by neighbor-joining (NJ) method using MEGA 7.0

图3 MSMO1蛋白包含保守的FA-hydroxylase结构域Fig.3 Conserved FA-hydroxylase domain of the broiler MSMO1 protein

2.2.2 MSMO1蛋白理化性质和结构分析 利用Protparam在线程序预测MSMO1蛋白相对分子质量为35 485.16 u，等电点(pI)为6.75，消光系数为90 675，脂肪指数为85.98，不稳定指数为38.69，属于不稳定蛋白。带正电荷的氨基酸残基数( Arg+Lys)为24个，带负电荷的残基数( Asp+Glu) 为26个，因此该蛋白质可能带负电荷。平均亲水系数为-0.024， 该蛋白为亲水蛋白。采用PSORTII在线软件分析MSMO1蛋白的细胞器定位，其分布概率分别为：高尔基体4.3 %，细胞核4.3 %，细胞质17.4 %，线粒体34.8 %，内质网39.1 %。利用SignalP 4.1服务器没有发现信号肽。用SOPMA程序预测鸡MSMO1二级结构为：α-螺旋占41.89 %，延伸链占21.96 %，β-转角占6.76 %，无规卷曲占29.39 %，因此MSMO1蛋白主要由α-螺旋和无规卷曲构成。利用SWISS-MODEL工具对MSMO1蛋白质进行三级结构预测，结果显示，三级结构图以4zr0.1.A为模板，序列一致性为20.90 %(图4)。

2.3 MSMO1基因组织表达模式分析

利用qPCR方法对MSMO1基因在肉鸡脂肪、肾脏、肺脏、脾脏、胸肌、腿肌、心脏和肝脏组织中的表达水平进行分析。结果发现，在上述8种组织中均检测到MSMO1基因mRNA的表达，且在肝脏中的表达水平极显著高于其它7种组织中的表达水平(P<0.01)，在脾脏和胸肌中的表达水平极显著低于在肺脏和肝脏中的表达水平(P<0.01，图5)。

3 小 结

通过RT-PCR方法[8]克隆得到了肉鸡MSMO1基因的部分序列，长度为1404 bp，编码296个氨基酸，并对其基因序列和蛋白结构特点进行了比较和分析；检测了该基因在脂肪、肾脏、肺脏、脾脏、胸肌、腿肌、心脏和肝脏组织中的表达模式。研究结果将为进一步研究MSMO1基因的结构和功能奠定基础，将丰富鸡基因组数据库。

图4 MSMO1蛋白三级结构Fig.4 Three-dimensional model prediction of broiler MSMO1 protein

4 讨 论

目前，对MSMO1基因的功能和结构的研究才刚刚开始。研究发现人类MSMO1基因有2种可变剪接，与转录变异体1相比，转录变异体2缺乏外显子2，在人类组织中转录变异体1是主要的RNA同种型[9]，而在小鼠中预测到3种可变剪接(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/?term=mouse+MSMO1)，其功能还不清楚。鸡是否存在可变剪接还不是太明了，尚需进一步研究。以前报道，MSMO1基因的rs17585739位点与高密度脂蛋白胆固醇相关[5]。最近，从人类MSMO1基因序列鉴定出519T→A和731A→G突变，这些突变导致氨基酸H173Q和Y244C的变化，这种变异在人群中是非常罕见的[1, 9]。也有报道，MSMO1基因内的变异与空腹胰岛素和胰岛素抵抗人群相关[6]。

MSMO1基因在人类组织中广泛表达，主要高表达于肝脏、大脑、肾上腺、淋巴母细胞、皮肤、睾丸和微管组织，在培养的表皮角质形成细胞和正常的白细胞也检测到了MSMO1基因的表达[8]。本研究表明，在所研究的肉鸡8种组织中均检测到MSMO1基因的表达，且在肝脏中的表达水平最高，与上述人类组织的表达水平一致。最近，临床研究表明，MSMO1基因在肝结石病人肝脏中表达水平明显增高[10]。在人Huh7肝肿瘤细胞的研究也显示，miR-223过表达能显著减少MSMO1基因的表达，而抑制miR-223表达却对MSMO1基因mRNA的表达水平没有改变[11]。另外，在人体肿瘤细胞中，脂类代谢的重要转录调节子PPARα和SREBP信号对话中能调节MSMO1基因的表达[12]。

图中数据表示平均数±标准误(n=5)，柱状图上不同大写字母表示差异达到极显著水平(P<0.01)Data are expressed as means ±std error (n=5), and the uppercase superscripts on the column show statistical difference among different tissues at 0.01 level图5 鸡MSMOS1基因的表达模式Fig.5 Expression patterns of broiler MSMO1 gene

综上所述，对MSMO1基因的研究才刚刚起步，且主要集中在MSMO1基因缺陷对人类疾病的研究方面，尚未见对畜禽类MSMO1基因的研究报道。因此，本研究结果将为进一步研究该基因在禽类方面的功能奠定基础。

[1]He M, Kratz L E, Michel J J, et al. Mutations in the human SC4MOL gene encoding a methyl sterol oxidase cause psoriasiform dermatitis, microcephaly, and developmental delay[J]. The Journal of Clinical Investigation, 2011, 121(3): 976-984.

[2]Vanparys C, Hectors T L, Blust R, et al. Mechanistic profiling of the cAMP-dependent steroidogenic pathway in the H295R endocrine disrupter screening system: new endpoints for toxicity testing[J]. Toxicology Letters, 2012, 208(2): 174-184.

[3]Cagnone G, Sirard M A. The impact of exposure to serum lipids during in vitro culture on the transcriptome of bovine blastocysts[J]. Theriogenology, 2014, 81(5): 712-722.

[4]Homo-Delarche F, Calderari S, Irminger J C, et al. Islet inflammation and fibrosis in a spontaneous model of type 2 diabetes, the GK rat[J].Diabetes,2006,55: 1625-1633.

[5]Lu Y, Dolle M E, Imholz S, et al. Multiple genetic variants along candidate pathways influence plasma high-density lipoprotein cholesterol concentrations[J].Journal of Lipid Research, 2008, 49: 2582-2589.

[6]Chen G, Bentley A, Adeyemo A, et al. Genome-wide association study identifies novel loci association with fasting insulin and insulin resistance in African Americans[J]. Human Molecular Genetics, 2012, 21(20): 4530-4536.

[7]Li L, Kaplan J. Characterization of yeast methyl sterol oxidase (ERG25) and identification of a human homologue[J].The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271: 16927 -16933.

[8]翁 梁.野桑蚕核糖体蛋白L21基因的克隆及序列分析[J].南方农业学报,2016,47(2):290-295.

[9]He M, Smith L D, Chang R, et al. The role of sterol-C4-methyl oxidase in epidermal biology[J].Biochimica et Biophysica Acta, 2014, 1841(3): 331-335.

[10]Käkelä P, Männistö V, Ilves I, et al. Serum Plant Sterols Associate with Gallstone Disease Independent of Weight Loss and Non-Alcoholic Fatty Liver Disease[J]. Obesity Surgery, 2017, 27(5): 1284-1291.

[11]Vickers K C, Landstreet S R, Levin M G, et al. MicroRNA-223 coordinates cholesterol homeostasis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111(40): 14518-14523.

[12]van der Meer D L, Degenhardt T, Väisänen S,et al. Profiling of promoter occupancy by PPARalpha in human hepatoma cells via ChIP-chip analysis[J].Nucleic Acids Research, 2010, 38(9): 2839-2850.

MolecularCloningandExpressionPatternsAnalysisofBroilerMSMO1Gene

XU Feng-hua, SONG Qi, XING Jin-yi*, SUN wei-han

(School of Life Science, Linyi University, Shandong Linyi 276000, China)

【Objective】The aims of this study are to clone broilerMSMO1 (methylsterol monooxygenase 1) gene sequences and analyze its expression patterns, which will provide a basis for further investigationMSMO1 gene function. 【Method】The broilerMSMO1 gene was cloned by RT-PCR, and the protein structure of broiler MSMO1 was predicted by bioinformatics methods, and expression patterns ofMSMO1 were assayed by real-time PCR (qPCR). 【Result】The broilerMSMO1 cDNA was 1404 bp in length, encoding 296 amino acids; MSMO1 protein of 145-274 amino acid residues sequence contained FA-hydroxylase domain, which was hydrophilicity protein. The phylogenetic tree analysis indicated that the broiler MSMO1 was closely related to the Japanese quail and parrot. The secondary structure of MSMO1 protein mainly contained alpha helix (41.89 %). TheMSMO1 mRNA were detected in all 8 tissues by using qPCR were detected, and the expression patterns in the liver were significantly higher than that in the other 7 tissues (P<0.01), and the expression levels in the spleen and breast muscle were significantly lower than that in the lung and liver (P<0.01). 【Conclusion】These results would provide the basis for the further research ofMSMO1 gene structure and function.

Broiler;MSMO1 gene; Cloning; Expression patterns

1001-4829(2017)12-2824-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.035

2017-01-20

山东省自然科学基金(ZR2017LC018, ZR2013CL01 2)；临沂大学校级大学生创新创业训练计划(201710452032)；国家自然科学基金(31372333)

徐凤华(1992-)，女，山东日照人，E-mail: 1697891180@qq.com， Tel: 17854278086； *为通讯作者：邢晋祎，E-mail: xingjinyi@lyu.edu.cn。

S831.2

A

(责任编辑陈 虹)