多型口蹄疫疫苗灭活时间和纯化的比较研究

赵书艺，崔 燕

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

多型口蹄疫疫苗灭活时间和纯化的比较研究

赵书艺，崔 燕*

(甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070)

【目的】为了探讨不同灭活时间及纯化对多型口蹄疫疫苗146 S、总蛋白量、抗原收获量及疫苗效力的影响。【方法】选取OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗为研究对象，设定不同灭活时间(8、10、12、14和16 h)，对每个时间点疫苗母液中146 S、总蛋白和抗原收获量进行检测和差异性分析；测量纯化前后146 S和总蛋白的变化趋势；测定不同灭活时间及纯化前后疫苗PD50数值进行判定效力。【结果】灭活不同时间点，146 S含量和抗原收获量随着时间先增高后平缓的趋势，146 S在14 h出现平缓，而抗原收获量在10 h时开始平缓；146 S含量OM和AF型明显高于Re-A和Asia1型，抗原收获量Asia1型最高；总蛋白含量随着时间呈现先降低后平缓的趋势，AF型口蹄疫疫苗降低最明显；疫苗纯化前后相比分析发现，146 S含量明显升高，总蛋白含量明显降低(P<0.01)。4种疫苗PD50值随着纯化时间先增大后平稳，纯化后PD50显著提高(P<0.01)，免疫效力增强。【结论】 OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗在纯化不同时间点，疫苗中146 S、抗原收获量和总蛋白含量呈规律性变化，且纯化前后146 S、总蛋白含量及PD50值差异性极显著，表明口蹄疫疫苗的灭活时间和纯化是影响疫苗效价的重要因素。

口蹄疫疫苗；纯化；抗原收获量；总蛋白；146 S

【研究意义】口蹄疫病毒根据地域及特征有7种不同血清型，各型之间几乎没有免疫保护力，针对不同的血清型病毒采用相应的灭活疫苗进行疫病防控。随着科学技术的不断发展出现很多新型疫苗，比如活载体疫苗、基因工程疫苗、空病毒衣壳蛋白疫苗、新型的弱毒疫苗、DNA疫苗、感染性克隆疫苗和合成肽疫苗等。新型疫苗的优缺点较为明显，例如口蹄疫空病毒衣壳疫苗接种后在血清中检测到高浓度的抗体[1]。【前人研究进展】疫苗是口蹄疫病毒最好的防控措施之一。最新报道，德国科学家实验证实通过ELISA检测试剂盒能够准确的对口蹄疫进行检测和诊断[2]。3AB1-ELISA是一个重要的快速检测接种口蹄疫病毒疫苗动物群体的试剂盒，优点不仅在于适合大量血清样本，还具有可靠、经济和简单等[3]。ELISA 可标记口蹄疫病毒基因的3’羧基末端，达到最口蹄疫的直接检测[4-5]。此外，实验动物模型证实小分子药物可通过选择性抑制口蹄疫病毒的复制而起到控制疫病的效果[6]。生产过程中很多因素决定了疫苗的免疫效价。随着技术的不断更新和改进，口蹄疫疫苗的筛选双抗夹心法-ELISA有着检测更加敏感，且146 S微粒能够分解蛋白酶的作用，基本取代了蔗糖密度梯度法[7]。此外，最新建立的微量双抗夹心法-ELISA检测O型口蹄疫疫苗技术，通过检测抗原146 S的量，不仅具备检测迅速、针对性强、可重复、高敏的特点，还可以大量应用于灭活疫苗的生产[8]。疫苗的灭活和纯化是影响效价的重要因素之一。规模化生产过程中温度36.5～37.0 ℃，pH值7.4～7.6，DO值为50.0 %～70.0 %，搅拌转速50～70 r/min时，可有效提高口蹄疫病毒增殖能力[9]。超滤纯化技术对口蹄疫灭活疫苗抗原纯化后，血清抗体水平较常规纯化显著升高，阳转率也高于常规灭活疫苗[10]。【本研究切入点】本文对4种不同型口蹄疫疫苗生产过程中，设定不同的灭活时间点及纯化前后测定疫苗中146 S、总蛋白量及抗原收获量，并通过检测LD50进行判定疫苗效力。【拟解决的关键问题】该实验详实的数据为口蹄疫疫苗的大规模生产提供重要的参考数据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

动态试管仪、蔗糖密度梯度形成仪、凯氏定氮仪、紫外分光光度计、超速冷冻离心机、电泳仪及电泳槽、-20 ℃冰箱、 高压锅、 垂直板电泳转移装置、 恒温水浴摇床、多用脱色摇床等。

单去污剂裂解液、0.01 mol/L PBS (pH 7.3)、10 %分离胶、4 %浓缩胶、G250 考马斯亮蓝溶液、0.15 mol/L NaCl溶液、SDS 上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂、鲎试剂、PEG6000、蔗糖、氯仿、丙烯酰胺等。

1.2 试验方法

1.2.1 口蹄疫 146 S 抗原含量的测定 按照蔗糖密度梯度离心与紫外分光光度计定量法[11]检测破乳后水相中 146 S 抗原含量。

1.2.2 总蛋白含量测定 采用凯氏定氮法，对疫苗样品进行总蛋白含量测定。

1.2.3 效力检测 每头份疫苗所含PD50的数值不能太少，对照猪至少有一例出现典型的口蹄疫水泡或者溃疡。

2 结果与分析

2.1 不同灭活时间点146 S、抗原收获量及总蛋白含量测定

由图1可以看出，4种不同型的口蹄疫疫苗，在灭活不同时间后146 S含量变化差异极显著。疫苗中146 S含量在8 h时基本相同，没有差异，6 h时AF和OM之间差异不显著，但是AF和Re-A，AF和Asia1，OM和Re-A，OM和Asia1相互之间差异显著。根据146 S含量增长趋势发现，4种疫苗在8～10，12～14 h变化极显著，但在10～12，14～16 h变化不显著。在16 h时不同疫苗中146 S含量值AF>OM>Re-A>Asia1，说明AF和OM型疫苗146 S含量对灭活时间更加敏感，其次Re-A和Asia1。

由图2可知，不同型的口蹄疫疫苗，在灭活不同时间后抗原收获量变化差异极显著。疫苗中抗原含量在8 h时基本相同，差异不显著，16 h时AF和OM之间含量差异不显著，但是AF和Re-A，AF和Asia1，OM和Re-A，OM和Asia1相互之间差异显著。根据抗原含量增长趋势发现，4种疫苗在8～10 h抗原含量增长极显著， AF、OM和Re-A在10～16 h抗原含量变化不显著，但Asia1在10～14 h抗原含量变化显著，14～16 h这4种疫苗抗原含量变化不显著。在16 h时不同疫苗中抗原收获量值Asia1>AF>Re-A>OM，说明Asia1型疫苗抗原收获量对灭活时间更加敏感。

图1 不同时间点AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中146 S含量Fig.1 146 S contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

图2 不同时间点AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中抗原收获量Fig.2 Antigen yield in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

由图3可见，不同型的口蹄疫疫苗，在灭活不同时间点总蛋白含量变化差异极显著。4种疫苗中总蛋白含量在8～10 h时变化：AF > Asia1>OM >Re-A；10～12 h Asia1>OM 和Re-A >AF；12～14 h AF总蛋白含量变化显著，而Asia1、OM、Re-A趋于平稳； 14～16h时4种疫苗中总蛋白含量变化才趋于平稳。在16 h时不同疫苗中总蛋白含量值Asia1>AF> Re-A >OM，说明Asia1和AF中总蛋白含量对灭活时间更加敏感。

2.2 纯化前后146 S和总蛋白含量测定

疫苗中146 S含量是疫苗质量的重要参数，从灭活样和纯化后检测数据可以发现，纯化后146 S含量较灭活样显著增高，表现为OM> Asia1> AF> Re-A；灭活样4种疫苗中146 S含量无显著差异，纯化后OM型疫苗146 S含量明显高于Asia1、 AF和Re-A ；然而，纯化后Asia1、AF、Re-A的146 S含量无显著差异。说明OM型疫苗146 S含量对纯化更加敏感(图4)。

图3 不同时间点AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中总蛋白含量Fig.3 Total protein contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time points

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差异显著(P<0.05),相同字母之间表明差异不显著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)图4 纯化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中146 S含量Fig.4 146 S contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

总蛋白含量影响着疫苗的效价，从纯化后和灭活样检测数据可以发现，纯化后总蛋白含量较灭活样显著降低，表现为Asia1> Re-A > AF > OM；而OM型差异明显高于Asia1、 AF和Re-A，且纯化后AF和Re-A之间差异不显著，说明OM型疫苗总蛋白含量对纯化更加敏感(图5)。

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差异显著(P<0.05)，相同字母之间表明差异不显著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P>0.05)图5 纯化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中总蛋白含量Fig.5 Total protein contents in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

不同字母A，B，C和D表明不同疫苗中差异显著(P<0.05)，相同字母之间表明差异不显著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)图6 不同时间点AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中每头份PD50测量值Fig.6 Each copy contains PD50 in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 at different time point

2.3 效力测定

标准规定，每头份疫苗至少含有6个PD50，对照猪至少有一例出现典型的口蹄疫水泡或者溃疡。检验得出结果为对照猪2/2发病，每头份疫苗所含PD50均多余6个，基本集中在10个左右，说明疫苗效力比较强。4种疫苗PD50值随着纯化时间先增大后平稳(图6)，纯化后PD50显著提高(P<0.01)，免疫效力增强(图7)。

3 讨 论

3.1 生产中灭活对疫苗效价的影响

生产条件的控制直接影响着疫苗对动物的免疫效力。该实验灭活前的细胞悬浮培养，如BHK-21细胞悬浮培养的培养液、pH、溶解氧、罐压、搅拌等都沿用最理想的细胞生长条件；例如在BHK-21细胞培养液中加入不同浓度的氨将直接影响细胞的生长代谢率[12-13]。研究证实，疫苗质量与细胞培养方式关系密切，悬浮培养的A/O/SAT-2口蹄疫疫苗相对于其他培养出现抗体效价时间提前，保护周期明显增长[14]。为了保证疫苗抗体的高效价，该实验过程中细胞的培养全部为悬浮培养技术，但生产中培养毒性高的口蹄疫病毒对病毒扩散有潜在的危险，疫苗可能有时含有口蹄疫病毒非结构蛋白(NSPs)[15]。研究发现组氨酸6标记的病毒和没有标记的病毒在传染性等功能上保留了相似性，说明高度纯化的组氨酸6标记口蹄疫病毒可以代替当前口蹄疫病毒抗原的净化、浓缩和伸缩性流程[16]。

不同字母A,B,C和D表明不同疫苗中差异显著(P<0.05),相同字母之间表明差异不显著(P>0.05)Different letters A, B, C and D represent that the difference was significant in the same column (P<0.05), the same letter represent that the difference was not significant in the same column (P > 0.05)图7 纯化前后AF、OM、Re-A和Asia1 4种疫苗中每头份PD50测量值Fig.7 Each copy contains PD50 in four kinds of vaccine AF, OM, Re-A and Asia1 before and after purification

该实验采用2次灭活，灭活罐需要在中间更换一次，这样有利于病毒的完全混合，能够保证灭活更加彻底[12]。此外，口蹄疫疫苗的效价随着储存时间的延长而减小，146 S会裂解为12 s使免疫原性降低[17]。本实验中不同型口蹄疫疫苗146 S含量在16 h含量差异变化明显，AF和OM型疫苗146 S含量对灭活时间更加敏感，Asia1型疫苗抗原收获量和总蛋白含量对灭活时间更加敏感。研究还发现高温处理下亚洲和亚洲1血清型中的146 S提前转换为12 S颗粒，可通过添加防腐剂硫柳汞来刺激抗原加快分解为12 S单体并保存于4 ℃，但分解的口蹄疫疫苗免疫原性明显降低[18]。

3.2 纯化对疫苗质量的影响

疫苗质量的检测指标较多，但146 S含量、抗原收获量和总蛋白含量是检测得最重要指数。XX等人发现双抗夹心-ELISA检测技术与蔗糖密度梯度法相比更加敏感，同时也表明146 S微粒具有分解蛋白酶的作用[19]。悬浮培养体系能够得到高质量的A/O/SAT-2口蹄疫疫苗，且抗原性在18 h出现峰值，并检测到完整的146 S病毒颗粒[20]。本实验发现纯化前后146 S显著增高，而总蛋白含量显著下降，OM型相对于其他型疫苗对纯化更加敏感，出现此种情况根本原因在于疫苗生产环节以及出厂疫苗所含有的有效 146 S 抗原、总蛋白及内毒素含量有着密切的关系。

3.3 疫苗效力对免疫效果的影响

疫苗效力是评价疫苗免疫力的重要参照。最新研究发现，多表位抗体蛋白口蹄疫病毒疫苗，在免疫的小鼠血清中抗体明显升高，说明当口蹄疫病毒发生变异时多表位抗体蛋白可以作为取代疫苗进行免疫[21]。2016年第1次证明家蚕幼虫可以被用作口蹄疫疫苗的生产，在口蹄疫病毒样颗粒(VLPs)疫苗的生产和诊断中具有重要的作用[22]。该实验发现，在最佳灭活时间，纯化后4种疫苗中PD50均多余6个，达到10个左右，通过进一步临床检验证实疫苗免疫效果优良，但极少数批次疫苗使用产生不同的免疫保护效果，有时也会出现明显的免疫失败，发生免疫应激造成死亡现象，说明疫苗质量是免疫保护的重要因素，但不是唯一因素。

4 结 论

该实验研究发现，OM/Re-A/AF/Asia1 4种不同型的口蹄疫疫苗，在不同灭活时间点，疫苗中146 S含量和抗原收获量随着纯化时间先增高后平缓的趋势，146 S和抗原收获量出现平缓的时间点不同。疫苗纯化前后相比发现，146 S含量明显升高，总蛋白含量明显降低(P<0.01)。4种疫苗PD50值随着纯化时间先增大后平稳，纯化后PD50显著提高(P<0.01)，免疫效力增强。总之，该研究说明灭活时间和纯化是影响疫苗效价的重要因素之一。

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【Objective】The aim of this study is to investigate the different types of foot and mouth disease vaccine of 146 S, total protein contents, antigen harvest and vaccine efficacy by inactivate time and purify.【Method】 OM/Re-`A/AF/Asia1 four different types of foot and mouth disease vaccine were selected as the research objects, setting different inactivated time (8, 10, 12, 14 and 16 hours), the difference of the 146 S, total protein contents and antigens harvest by each point-in-time were analyzed, and the changing trends of total protein and 146 S before and after purification were measured. The vaccine effect of PD50numerical at different time inactivated and before-after purification was identified. 【Result】At the different time points of inactivated, 146 S and antigen harvest with the time of increased first and then gentle trend, the 146 S appeared flat at 14 hours, but the antigen harvest began to gently at 10 hours; The 146 S content in OM and AF was significantly higher than that of Re-A and Asia1, and antigen harvest was the highest in Asia1; Purified over time and total protein content showed a trend of first decreases and then gentle, AF type of foot and mouth disease vaccine lowers was the most obvious; Compared of vaccine before and after purification, it was found that 146 S levels increased significantly, total protein content significantly decreased (P<0.01). Four types of vaccine PD50value with the purification time firstly increases and then was smooth, purified PD50significantly increased (P<0.01), increasing the immune effect.【Conclusion】With the purification of OM/Re-A/AF/Asia1 four different types of foot and mouth disease vaccine at different time points, 146 S, antigen harvest and total protein were regularly changed in vaccine, and the 146 S, total proteins and PD50value difference significantly in before-after purification. This study indicated that the inactivated time and purification was one of the important factors in affecting vaccine titer.

FMDV; Purification; Antigen harvest; Total proteins; 146 S

1001-4829(2017)12-2833-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.12.037

2017-07-10

国家自然基金项目 “冷应激因子CIRP和HSP70与牦牛高寒低氧环境的适应性机制”(31360594)

赵书艺(1982-)，女，助理经济师，从事生物制品行业，E-mail：rose.zsy88@163.com；*为通讯作者：崔 燕(1962-)，女，教授，博士生导师，从事解剖与组织胚胎学研究，E-mail：Cuiyan369@sina.com。

S852.4

A

AnalysisofPolytypeFoodandMouthDiseaseVaccinebyInactivateTimeandPurify

ZHAO Shu-yi，CUI Yan*

(College of Veterinary Medicine, Gansu Agricultural University, Gansu Lanzhou 730070, China)

(责任编辑陈 虹)