表没食子儿茶素没食子酸酯对中波紫外线诱导小鼠皮肤黑素小体转移与降解的影响

贾肖肖 胡文婷 王敏 华优 高亚丽 耿清伟 李刘雨 宋秀祖

310009杭州，浙江中医药大学附属杭州第三医院 杭州市第三人民医院皮肤科

·论著·

表没食子儿茶素没食子酸酯对中波紫外线诱导小鼠皮肤黑素小体转移与降解的影响

贾肖肖 胡文婷 王敏 华优 高亚丽 耿清伟 李刘雨 宋秀祖

310009杭州，浙江中医药大学附属杭州第三医院 杭州市第三人民医院皮肤科

目的观察茶多酚单体表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对中波紫外线（UVB）诱导小鼠皮肤色素沉着及黑素小体转移和降解的影响，探讨自噬在其中的作用机制。方法将16只C57/BL6雌性小鼠32只鼠耳用简单随机方法随机等分为4组：①丙酮对照组：每日予丙酮溶液外涂耳部皮肤；②EGCG组：每日予10 g/L EGCG丙酮溶液外涂；③UVB照射组：单次500 mJ/cm2UVB照射，照射2 h后每日外涂丙酮溶液；④UVB+EGCG组：单次UVB照射2 h后每日外涂EGCG丙酮溶液。10 d后处死小鼠，收集耳部皮肤，透射电镜观察黑素小体及自噬体超微结构变化，免疫组化法检测蛋白酶活性受体2（PAR2）及微管相关蛋白轻链3（LC3）在表皮中的表达，免疫印迹法检测PAR2、Rab27a及LC3在表皮中的表达。结果丙酮对照组、UVB照射组、UVB+EGCG组和EGCG组间黑素小体及自噬体数量差异均有统计学意义（H值分别为12.249、13.888，均P＜0.05）；与丙酮对照组小鼠皮肤角质形成细胞内黑素小体数量（1.00±0.41）、自噬体数量（1.00±0.46）相比，UVB照射组黑素小体（1.85±0.32）和自噬体（1.94±0.64）均显著增加（均P＜0.05）；相较于UVB照射组，UVB+EGCG组黑素小体（1.30±0.44）显著减少（P＜0.05），而自噬体（3.03±0.75）则明显增加（P＜0.05）。免疫组化显示，4组间PAR2在表皮中的表达差异有统计学意义（H=18.700，P＜0.05）；与UVB照射组（12.54±3.07）比较，UVB+EGCG组PAR2表达（7.94±4.57）显著减少（Z=2.143，P＜0.05）；但4组表皮LC3表达均不明显，表达水平差异无统计学意义（H=5.051，P＞0.05）。免疫印迹显示，4组间PAR2、Rab27a表达及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值差异均有统计学意义（F值分别为18.739、25.967、24.022，均P＜0.05）；与UVB照射组（PAR2 3.12±0.61，Rab27a 1.42±0.07，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ1.24±0.07）比较，UVB+EGCG组PAR2（0.91±0.54）、Rab27a（0.99±0.16）表达均显著减少（P＜ 0.05），而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值（1.67± 0.08）则显著增加（P＜0.05）。结论外用EGCG能有效抑制UVB诱导的皮肤色素沉着，其作用机制可能与抑制黑素小体转运及促进黑素小体自噬有关。

多酚类；紫外线；自噬；黑素类；表没食子儿茶素没食子酸酯

黑素代谢包括黑素合成、转运和降解。目前对于色素沉着机制研究大多集中在黑素合成和转运，对黑素降解的研究较少。黑素降解是一个复杂而精细的过程，细胞自噬是其可能的降解机制［1⁃2］，研究黑素的降解机制有助于探索新的治疗方向。我们采用中波紫外线（UVB）照射小鼠诱导产生皮肤色素沉着模型，并外用茶多酚单体表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）处理，观察黑素转运和降解变化，探讨自噬在黑素降解中的作用机制，为茶多酚外用治疗黄褐斑等色素沉着性皮肤病提供新的理论依据。

材料与方法

一、实验动物、试剂及仪器

16只健康SPF级6～8周龄C57/BL6雌鼠由浙江中医药大学动物研究中心提供，合格证号2008001655143，实验动物使用许可证号［SYXK（浙）2013⁃0184］，体重（16.3 ± 0.87）g，于SPF级实验动物屏障环境下饲养。紫外线光疗仪SS⁃04B、UVB辐照度监视器来自上海希格玛高科技有限公司，光源使用德国飞利浦公司宽波UVB紫外线低压灯管。EGCG（美国Sigma公司），25%戊二醛溶液（美国Sigma⁃Aldrich公司），鼠抗Rab27a单克隆抗体、鼠抗蛋白酶活性受体2（PAR2）单克隆抗体及兔抗微管相关蛋白轻链3（LC3）多克隆抗体均来自美国Abcam公司。

二、实验动物分组及处理

将16只C57/BL6雌性小鼠32只鼠耳用简单随机化方法随机分为4组，每组8只鼠耳，①丙酮对照组：每日予以丙酮溶液外涂耳部皮肤；②EGCG组：每日予以10 g/L EGCG丙酮溶液外涂耳部皮肤；③UVB照射组：单次照射UVB，剂量500 mJ/cm2，照射2 h后每日外涂丙酮溶液；④UVB+EGCG组：单次500 mJ/cm2UVB照射2 h后，每日外涂EGCG丙酮溶液。如一只小鼠的两只耳朵被分到非照射组和照射组，对非照射组耳朵则予以纸板遮挡。10 d后处死小鼠，收集耳部皮肤进行相应实验。

三、透射电镜观察黑素小体及自噬体变化

常规取小鼠耳部皮肤，置于预冷2.5%戊二醛固定液中，1%锇酸溶液固定，常规梯度乙醇脱水，丙酮浸透，包埋，聚合，超薄切片并染色。透射电镜下观察，拍照，每组选8个视野进行统计学分析。

四、免疫组化检测PAR2及LC3表达

小鼠耳部皮肤常规处理，石蜡包埋、切片、脱蜡，3%过氧化氢溶液室温孵育，加热修复抗原，封闭液封闭。加入一抗鼠抗PAR2单克隆抗体及兔抗LC3多克隆抗体，4℃湿盒孵育过夜。用PBS浸洗3次，每次5 min，继之滴加二抗羊抗鼠或羊抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP），PBS浸洗3次，3，3-二氨基联苯胺（DAB）显色，封片。显微镜下观察，每张玻片采用简单随机方法随机选3个视野拍照，图像分析系统测定吸光度（A值），取均值作为蛋白表达水平。

五、免疫印迹检测PAR2、Rab27a及自噬相关蛋白LC3表达

分离各组小鼠表皮组织，剪碎，液氮冷冻研磨，裂解液裂解，提取蛋白并进行定量。每孔加入相同量总蛋白30 μg进行垂直凝胶电泳，硝酸纤维素膜转膜，5%脱脂牛奶室温包被1 h。继之分别加入鼠抗PAR2、Rab27a单克隆抗体及兔抗LC3多克隆抗体，4℃孵育过夜。TBST溶液洗膜3次，每次15 min。再加入HRP标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，室温孵育1 h，TBST溶液洗膜3次。化学发光法检测目的条带并分析条带灰度值，以目的蛋白/β肌动蛋白灰度比值代表蛋白表达水平，并设定丙酮对照组为1进行分析。

六、统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，各组间PAR2、Rab27a与LC3的免疫印迹检测结果通过单因素方差分析比较，并用SNK法进行两两比较。黑素小体及自噬体数量、PAR2与LC3的免疫组化检测结果用Kruskal⁃WallisH检验，并用Mann⁃Whitney检验进行两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、UVB及EGCG处理后小鼠皮肤黑素小体变化

UVB照射组小鼠照光后第3天耳部皮肤开始出现明显充血、红斑、轻微脱屑及色素沉着，第10天出现明显色素沉着，与UVB+EGCG组相比，肉眼观察皮肤颜色未见显著差异。见图1。

透射电镜观察显示，每组小鼠表皮角质形成细胞及黑素细胞中均可见清晰的黑素小体结构，表现为致密深黑色圆形或椭圆形颗粒样结构，着色程度不同，散在或成簇分布在细胞质中。4组间黑素小体数量（表1）差异有统计学意义（P＜0.05），与丙酮对照组相比，EGCG组小鼠皮肤黑素小体未见显著变化（Z=0.081，P＞0.05），UVB照射组显著增加（Z=2.802，P＜0.05）；与UVB照射组比较，UVB+EGCG组黑素小体明显减少，差异有统计学意义（Z=2.887，P＜0.05）。见表1、图2。

图1 各组小鼠耳部皮肤情况 丙酮对照组肉眼观察实验前后耳部皮肤无明显变化；EGCG组实验前后耳部皮肤无明显变化，实验第10天与丙酮对照组相比，亦无明显差异；UVB照射组实验（照光后）第3天皮肤开始出现色素沉着，第10天更加显著；UVB+EGCG组实验（照光后）第10天与UVB照射组相比，皮肤色素沉着程度无明显差异。EGCG：表没食子儿茶素没食子酸酯；UVB：中波紫外线

表1 中波紫外线（UVB）与表没食子儿茶素没食子儿酸酯（EGCG）处理后小鼠皮肤黑素小体、自噬体数量以及蛋白酶活性受体2（PAR2）与抗微管相关蛋白轻链3（LC3）等的表达（±s）

表1 中波紫外线（UVB）与表没食子儿茶素没食子儿酸酯（EGCG）处理后小鼠皮肤黑素小体、自噬体数量以及蛋白酶活性受体2（PAR2）与抗微管相关蛋白轻链3（LC3）等的表达（±s）

注：n=8。a与丙酮对照组相比，P ＜0.05；b与UVB照射组相比，P＜0.05；cH值；dF值

组别丙酮对照组UVB照射组UVB+EGCG组EGCG组F/H值P值黑素小体（个/视野）1.00±0.41 1.85±0.32a 1.30±0.44b 0.99±0.32 12.249c＜0.05自噬体（个/视野）1.00±0.46 1.94±0.64a 3.03±0.75b 1.15±0.25 13.888c＜0.05免疫组化（A值）PAR2 1.00±1.31 12.54±3.07a 7.94±4.57b 0.67±0.21 18.700c＜0.05 LC3 1.00±0.02 1.28±0.13 1.54±0.41 1.08±0.42 5.051c＞0.05免疫印迹PAR2 1.00±0.35 3.12±0.61a 0.91±0.54b 0.44±0.33 18.739d＜0.05 Rab27a 1.00±0.15 1.42±0.07a 0.99±0.16b 0.39±0.17 25.967d＜0.05 LC3Ⅱ/LC3Ⅰ1.00±0.07 1.24±0.07a 1.67±0.08b 1.26±0.28 24.022d＜0.05

二、UVB与EGCG处理后小鼠皮肤自噬体变化

透射电镜观察显示，丙酮对照组小鼠表皮角质形成细胞内可见自噬溶酶体及溶酶体内的黑素小体集合体结构（图3）。4组间自噬溶酶体数量差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。与丙酮对照组相比，EGCG组小鼠角质形成细胞中自噬溶酶体增多，但差异无统计学意义；UVB照射组明显增加，约为丙酮对照组的1.94倍，差异有统计学意义（Z=2.102，P＜0.05），但黑素小体集合体未见增多。与UVB照射组比较，UVB+EGCG组小鼠角质形成细胞中自噬溶酶体增加更为显著，约为丙酮对照组的3.03倍，且溶酶体内黑素小体集合体多见，差异有统计学意义（Z=1.991，P＜0.05）。

三、PAR2与LC3免疫组化检查结果

UVB照射组小鼠表皮呈反应性增生，UVB+EGCG组小鼠表皮亦明显增厚。免疫组化结果显示，4组小鼠表皮PAR2表达差异有统计学意义（P＜0.05），丙酮对照组与EGCG组表达差异无统计学意义（Z=0.816，P＞0.05）；而UVB照射组表达显著增加，约为丙酮对照组的12.54倍（Z=3.240，P＜0.05），亦显著高于UVB+EGCG组（Z=2.143，P＜0.05）。见表1、图4。

4组LC3在表皮表达不明显，各组之间表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

四、PAR2、Rab27a与LC3免疫印迹检查结果

4组小鼠表皮PAR2表达差异有统计学意义（P＜0.05），UVB照射组约为丙酮对照组的3.12倍（q=5.148，P＜0.05），亦显著高于UVB+EGCG组（q=4.642，P＜ 0.05）。见表1、图5。

4组小鼠表皮Rab27a表达差异有统计学意义（P＜0.05），UVB照射组约为丙酮对照组的1.42倍（q=4.483，P＜0.05），亦显著高于UVB+EGCG组（q=4.263，P＜ 0.05）。见表1、图5。

4组小鼠表皮LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值差异有统计学意义（P＜0.05），UVB照射组LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值约为丙酮对照组的1.24倍（q=4.072，P＜0.05），但低于UVB+EGCG组（q=6.959，P＜0.05）。见表1、图5。

图2 透射电镜观察中波紫外线（UVB）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）处理后小鼠皮肤黑素小体（红色箭头）的变化 2A：丙酮对照组，细胞核旁可见少量黑素小体，散在分布；2B：UVB组，黑素小体明显增多；2C：UVB+EGCG组，与UVB组相比黑素小体减少；2D：EGCG组，少量黑素小体分布于核周，数量与丙酮对照组无明显差异

图3 透射电镜观察中波紫外线（UVB）与表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）处理后小鼠皮肤自噬体的变化 3A：丙酮对照组，可见膜结构状自噬溶酶体及溶酶体内黑素小体集合体；3B：UVB组，自噬溶酶体明显增多，并见少量溶酶体内黑素小体集合体；3C：UVB+EGCG组，自噬溶酶体明显增加，且溶酶体内黑素小体集合体多见；3D：EGCG组，与对照组相比自噬体稍增多，可见少量溶酶体内黑素小体集合体。红色箭头示自噬溶酶体，蓝色箭头示溶酶体内黑素小体集合体

图4 各组小鼠耳部皮肤蛋白酶活性受体2（PAR2）的表达变化（免疫组化×200） 4A：丙酮对照组，表皮无明显变化，PAR2少量表达；4B：UVB组，表皮明显增厚，PAR2表达增加；4C：UVB+EGCG组，表皮明显增厚，与UVB组相比，PAR2表达减少；4D：EGCG组，表皮无明显变化

图5 免疫印迹检测转运相关蛋白酶活性受体2（PAR2）、Rab27a与微管相关蛋白轻链3（LC3）的表达变化 1：丙酮对照组；2：中波紫外线（UVB）照射组；3：UVB+表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）组；4：EGCG组

讨 论

黄褐斑是临床常见的色素增加性皮肤病，病理表现为表皮全层黑素颗粒增加，与黑素代谢异常有关［3］。在黑素代谢过程中，黑素小体在黑素细胞中合成后转移入角质形成细胞并重新分布和降解，随角质形成细胞不断分化逐层上移，最后随角质层脱落而排出［4］。黑素小体转移至角质形成细胞并在其中降解的过程，对皮肤的色素代谢至关重要，其功能紊乱可导致皮肤色素沉着。

UVB照射可以促进黑素细胞增殖、黑素合成增加，也可以促进黑素小体向角质形成细胞中转运增加［5］。Rab27a是一种组织特异性蛋白，Kukimoto⁃Niino等［6］研究发现，Rab27a可与其特异效应分子Slac2⁃a结合，定位到成熟黑素小体表面，介导黑素小体转运。PAR2位于角质形成细胞膜表面，是跨膜G蛋白耦联受体，可被丝氨酸蛋白酶剪切而活化，进一步介导黑素小体转移［7］。本研究显示，UVB照射后，小鼠皮肤黑素小体显著增加，转运相关蛋白Rab27a及PAR2表达明显增多，表明UVB照射可以促进黑素小体转运，其机制可能与促进Rab27a及PAR2表达增加有关。既往研究证实，EGCG能够抑制黑素细胞小眼畸形相关转录因子（MITF）转录活性，抑制酪氨酸酶活性和蛋白表达，从而抑制黑素合成［8］。本研究中我们采用EGCG丙酮溶液外涂小鼠皮肤，结果显示，EGCG可以抑制UVB照射诱导的Rab27a及PAR2表达，从而抑制黑素小体转运和转移；电镜下发现，EGCG处理后小鼠皮肤角质形成细胞中黑素小体显著减少，表明EGCG可以通过抑制黑素小体的转运和转移发挥美白作用。

黑素小体转运至角质形成细胞后进行再分布与降解，其降解机制与细胞自噬相关。Murase等［1］研究发现，白种人角质形成细胞自噬活性比黑种人高，自噬可能通过促进角质形成细胞中黑素小体的降解而使皮肤颜色变白。进一步采用特异性siRNA抑制自噬相关基因ATG7表达可以显著增加黑素小体PMEL17的表达，同时伴有自噬相关蛋白LC3Ⅱ蛋白表达减少，表明抑制自噬可以减少黑素小体降解。Kim等［9］研究发现，通过诱导细胞自噬反应，可以显著抑制α促黑素细胞激素（α⁃MSH）引起的皮肤色素沉着。这些研究均证实，细胞自噬参与角质形成细胞内黑素小体降解。既往研究已经证实，UVB照射可以促进角质形成细胞的自噬活性［10⁃11］，而EGCG也可以促进血管内皮细胞的自噬活性，减少脂质沉积［12］。电镜下自噬溶酶体是溶酶体单层膜空泡样结构，其内含吞噬的细胞器碎片；自噬体是经典的双层膜结构；部分溶酶体内可见黑素小体集合体，认为是溶酶体包裹多个黑素小体形成的结构。由于自噬是动态的自噬流，因此电镜可能难以捕捉到，本研究电镜可能观察到的是自噬溶酶体。本研究电镜结果显示，UVB照射后小鼠皮肤角质形成细胞自噬泡及自噬溶酶体明显增加，但溶酶体内未见黑素小体集合体；EGCG处理后角质形成细胞中自噬泡及自噬溶酶体进一步增加，可能提示黑素小体降解增多。既往研究认为，黑素小体集合体是溶酶体包裹的黑素小体，通常在浅色皮肤中较易发现；黑素小体被溶酶体包裹后更易降解，从而导致皮肤颜色变淡［13⁃15］。黑素小体集合体可以是黑素细胞转移而来，也可以是角质形成细胞内溶酶体吞噬形成，本研究中未用免疫电镜标记，尚不能精确区分，但仍提示EGCG可能促进溶酶体吞噬黑素小体，加速黑素小体降解。本研究免疫组化结果未提示EGCG处理后表皮LC3表达增加，推测原因可能是表皮总LC3生成没有显著增加。但免疫印迹发现，EGCG处理后，UVB+EGCG组较UVB组小鼠表皮LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著增加，推测其原因可能是EGCG通过增加LC3Ⅱ表达促进自噬发生。另外，EGCG也可以通过其他途径促进自噬，如AKT/STAT3途径等［16］。我们在今后研究中将进一步探讨EGCG的其他促自噬机制。

本研究发现，EGCG能够有效抑制UVB诱导皮肤色素沉着，作用机制可能与抑制黑素转运及促进黑素降解有关。EGCG抑制黑素转运的机制可能与抑制转运相关蛋白Rab27a及PAR2表达有关，促进黑素降解的机制可能与促进自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和增加细胞自噬有关。提示可能通过促进细胞自噬诱导黑素小体降解。

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Effect of epigallocatechin gallate on ultraviolet B⁃induced transfer and degradation of melanosomes in mice

Jia Xiaoxiao,Hu Wenting,Wang Min,Hua You,Gao Yali,Geng Qingwei,Li Liuyu,Song Xiuzu
Department of Dermatology,Hangzhou Third Hospital,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou 310009,China

Song Xiuzu,Email:songxiuzu@sina.com

ObjectiveTo evaluate the effect of tea polyphenol epigallocatechin gallate（EGCG）on ultraviolet B（UVB）⁃induced skin pigmentation,transfer and degradation of melanosomes in mice,and to explore the role of autophagy in the mechanism of melanosome degradation.MethodsA total of 32 ears from 16 female C57/BL6 mice were randomly and equally divided into 4 groups:acetone control group topically treated with acetone solution daily,EGCG group topically treated with 10 g/L EGCG acetone solution daily,UVB irradiation group irradiated with 500 mJ/cm2UVB once a day and 2 hours later topically treated with acetone solution,UVB+EGCG group irradiated with 500 mJ/cm2UVB once a day and 2 hours later topically treated with EGCG acetone solution.Ten days later,all the mice were sacrificed,and skin tissue samples were collected from the ears.Transmission electron microscopy was performed to observe ultrastructural changes of melanosomes and autophagosomes,immunohistochemical study to measure expression of protease⁃activated receptor 2（PAR2）and microtubule⁃associated protein light chain 3（LC3）in the epidermis,and Western blot analysis to determine the protein expression of PAR2,Ras⁃related protein Rab27a and LC3 in the epidermis.ResultsThere was a significant difference in the number of melanosomes and autophagosomes among the acetone control group,EGCG group,UVB irradiation group and UVB+EGCG group（H=12.249,13.888,respectively,bothP＜ 0.05）.Compared with the acetone control group,the UVB irradiation group showed significantly increased number of melanosomes（1.85±0.32vs.1.00±0.41,P＜0.05）and autophagosomes（1.94±0.64vs.1.00±0.46,P＜0.05）in epidermal keratinocytes in mouse skin.Compared with the UVB irradiation group,the UVB+EGCG group showed significantly decreased number of melanosomes（1.30 ± 0.44,P＜ 0.05）,but significantly increased number of autophagosomes（3.03 ± 0.75,P＜ 0.05）.Immunohistochemical study showed a significant difference in the level of PAR2 in the epidermis among the 4 groups（H=18.700,P＜0.05）,and the expression of PAR2 was significantly lower in the UVB+EGCG group than in the UVB irradiation group（7.94±4.57vs.12.54±3.07,Z=2.143,P＜0.05）.However,the 4 groups all showed a low level of LC3,and there was no significant difference among the 4 groups（H=5.051,P＞ 0.05）.Western blot analysis revealed significant differences in the protein expression of PAR2 and Rab27a,as well as in the LC3⁃Ⅱ/LC3⁃Ⅰratio,among the 4 groups（F=18.739,25.967,24.022,respectively,allP＜0.05）.Compared with the UVB irradiation group,the UVB+EGCG group showed significantly decreased expression of PAR2（0.91±0.54vs.3.12±0.61,P＜0.05）and Rab27a（0.99±0.16vs.1.42±0.07,P＜0.05）,but significantly increased LC3⁃Ⅱ/LC3⁃Ⅰratio（1.67 ± 0.08vs.1.24 ± 0.07,P＜ 0.05）.ConclusionTopical EGCG treatment can effectively suppress UVB⁃induced skin pigmentation,which may be related to the inhibition of melanosome transfer and promotion of melanosome autophagy.

Polyphenols;Ultraviolet rays;Autophagy;Melanins;Epigallocatechin gallate

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81000697）;Hangzhou Science and Technology Development Program（20130733Q24）

宋秀祖，Email：songxiuzu@sina.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2017.12.001

国家自然科学基金（81000697）；杭州市科技发展计划项目（20130733Q24）

2016⁃10⁃13）

尚淑贤）