芒柄花素平衡溶解度和油水分配系数的测定

廖灿城，许丹翘，刘晓红，吴秀君 ，黄泽贤 ，易 军，郭波红*

（1.广东药科大学药学院，广东广州510006；2.广东省妇幼保健院，广东广州510010）

芒柄花素平衡溶解度和油水分配系数的测定

廖灿城1，许丹翘1，刘晓红1，吴秀君2，黄泽贤1，易 军1，郭波红1*

（1.广东药科大学药学院，广东广州510006；2.广东省妇幼保健院，广东广州510010）

目的 测定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系数，为设计芒柄花素新剂型提供理论基础与依据。方法 采用高效液相色谱（HPLC）法测定芒柄花素在水、不同缓冲盐溶液中的质量浓度，并运用摇瓶法测定芒柄花素在正辛醇-水、缓冲液体系中的表观油水分配系数。结果 37℃下芒柄花素在水中的平衡溶解度为2.079±0.036μg·mL-1，随着pH值增大，芒柄花素的平衡溶解度增大。芒柄花素在正辛醇-水体系中的表观油水分配系数lg Papp=2.79±0.03，随着缓冲盐溶液的pH值增大，芒柄花素在正辛醇-缓冲盐溶液体系中的油水分配系数减小。结论建立的方法可以准确测定芒柄花素的平衡溶解度和表观油水分配系数，科学合理地预测药物在体内的吸收与分布情况。

芒柄花素；平衡溶解度；高效液相色谱法；油水分配系数

近年来发现，芒柄花素（7—羟基—4′—甲氧基异黄酮）是一种异黄酮类化合物，主要存在于红车轴草［1］、刺芒柄花［2］、黄芪［3］等植物中，其化学结构见图1。芒柄花素具有较好的抗肿瘤作用，已被应用于乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌等治疗，此外还有治疗骨质疏松、改善妇女更年期症状等用途，因而备受关注［4-9］。测定芒柄花素的平衡溶解度和油水分配系数对研究其体内过程，可以比较科学合理地预测药物的生物利用度，为新剂型的设计开发提供了处方前研究的基础，对指导临床用药也有着重要的意义。因此，本次试验采用高效液相色谱（HPLC）法测定芒柄花素的质量浓度，并运用摇瓶法测定油水分配系数，为其设计剂型提供研究基础。

图1 芒柄花素的化学结构图

1 仪器与试剂

安捷伦1200高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Sartorius BS110S电子天平（北京赛多利斯天平有限公司）；PKZ-1电热恒温振荡水槽（上海精密实验设备有限公司）；芒柄花素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111703-201504）；芒柄花素原料药（成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度≥98%，批号：C-018-150728）；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氢氧化钠（AR级，广州化学试剂厂）；甲醇（色谱纯，北京迪马公司）；水为超纯水，其余试剂为市售分析纯。

2 方法与结果

2.1 芒柄花素分析方法的建立

2.1.1 溶液的制备

对照品溶液的制备：精密称取适量芒柄花素对照品，加甲醇使之溶解，制成浓度为30μg·mL-1的对照品储备液。从对照品储备液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，得到浓度为6μg·mL-1的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密称取适量芒柄花素原料药，加甲醇使之溶解，制成浓度为30μg·mL-1芒柄花素供试品储备液。从供试品储备液中精密移取2mL于10mL量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，得到浓度为6μg·mL-1的供试品溶液。

不同pH磷酸盐缓冲液的制备：按照2015版《中国药典》第四部中通则的磷酸缓冲盐溶液配制方法进行制备。

2.1.2 测定波长的选择

取适量芒柄花素对照品加甲醇溶解，在波长200～800 nm进行扫描，芒柄花素在波长249 nm处有最大吸收峰，磷酸缓冲盐溶液在此波长处无吸收，不干扰芒柄花素的测定，因此选定249 nm作为检测波长。

2.1.3 高效液相色谱（HPLC）条件

色谱柱为Dikma Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇-0.1%磷酸的水溶液（体积比为70∶30），检测波长 249 nm，进样量 20 μL，流速 1mL·min-1，柱温 30 ℃。

2.1.4 线性关系考察

分别从芒柄花素储备液中依次精密移取0.25、0.5、1、2、4、8mL分别至于10mL容量瓶中，再用流动相分别稀释定容，摇匀得到0.75、1.5、3、6、12、24 μg·mL-1的系列浓度的芒柄花素对照品溶液，过 0.45 μm微孔滤膜，进样测定含量。由芒柄花素峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程Y=130.71 X+16.272，γ=0.999 7，表明 0.75～24 μg·mL-1线性关系良好

2.1.5 专属性实验

取流动相、供试品溶液、对照品溶液分别按设定的色谱条件进样，记录图谱，结果见图2，可见芒柄花素峰形良好，溶剂无干扰，专属性良好。

图2 芒柄花素高效液相色谱图

2.1.6 精密度实验

取低、中、高浓度分别为1.5、6、24μg·mL-1的芒柄花素对照品溶液，按照“2.1.3”项下的色谱条件，连续进样6次，得色谱图峰面积积分并计算其相对标准偏差（RSD）分别为0.35%、0.28%、0.39%（n＝6）。24、48、72 h后平行操作，得到日间精密度的RSD分别为0.35%、0.12%、0.53%（n=3），表明仪器的精密度良好。

2.1.7 回收率实验

依次从供试品储备液中精密量取0.25、1、4mL分别置于5mL容量瓶中，加流动相定容至刻度线，得到浓度为1.5、6、24μg·mL-1的低、中、高浓度的芒柄花素供试品溶液，每种浓度的芒柄花素供试品溶液制备3份，共9份。按“2.1.3”项下色谱条件进样，按标准曲线法计算含量，分别计算回收率，结果平均回收率分别为101.72%±0.44%、98.60%±0.25%、99.20%±0.39%，表明该方法的回收率符合要求。

2.1.8 稳定性试验

取芒柄花素供试品溶液，在 0、4、8、12、24、36、48、72 h，分别进样 20 μL，测定峰面积，结果 RSD 为0.57%。表明供试品溶液在72 h内稳定。

2.1.9 检测限与定量限

逐步稀释对照品溶液，当信噪比S/N=3∶1确定检测限，信噪比S/N=10∶1确定定量限，结果芒柄花素的检测限为 0.024 8 μg·mL-1，定量限为 0.0744 μg·mL-1。

2.2 芒柄花素的平衡溶解度测定［10］

取若干份过量芒柄花素置于100 mL具塞三角瓶中，分别加入水或 pH 值 2.0，5.0，5.8，6.8，7.4，8.0 磷酸盐缓冲溶液，超声至芒柄花素不再溶解，置于37℃水浴恒温振荡器，150 r·min-1振摇48 h，取适量经0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，续滤液用流动相稀释至一定浓度后进样。由标准曲线计算芒柄花素在不同pH磷酸缓冲液中的溶解度，结果见表1。结果表明芒柄花素在水或不同pH值磷酸盐缓冲液中几乎均不溶，在碱性环境中的溶解度略优于酸性环境，提示芒柄花素在胃肠中溶解性很差。

表1 芒柄花素在水或不同pH值磷酸盐缓冲液中的平衡溶解度

2.3 芒柄花素的油水分配系数测定

2.3.1 正辛醇饱和溶液的制备［11］

取一定体积正辛醇溶液加入等体积水中密封后置于磁力搅拌器上，37℃恒温搅拌24 h，转移至分液漏斗内，静置数小时后，分别取上层水饱和的正辛醇及下层正辛醇饱和的水备用。

2.3.2 表观油水分配系数测定［12-13］

取适量芒柄花素加入一定体积水饱和正辛醇，超声至充分溶解后，经0.45μm微孔滤膜滤过，制备芒柄花素-正辛醇溶液，取适量进样，测定其在水饱和正辛醇中的浓度C1；取上述一定体积芒柄花素-正辛醇溶液置于具塞三角瓶中，再分别按1∶5的体积比例加入相应体积正辛醇饱和的各pH磷酸盐缓冲溶液，置于37℃水浴恒温振荡器中，150 r·min-1振荡48 h，静置分层，取下层水相适量，经0.45μm微孔滤膜滤过，进样并计算浓度C2，按照下式计算芒柄花素的表观油水分配系数Papp，结果见表2。

实验结果表明，芒柄花素在水中的表观分配系数为616.6（lg Papp=2.79），在一定pH范围内，芒柄花素的表观油水分配系数随着pH的增大而减小，在pH8.0缓冲液中的表观分配系数最小为257（lg Papp=2.41）。

3 讨论

表2 芒柄花素在各pH值的正辛醇/磷酸缓冲液的表观油水分配系数

目前测定药物油水分配系数最常用的方法是摇瓶法，在理论上并没有对正辛醇-水的比例进行规定，只是从原则上进行指导，水相的体积可以根据药物在水中溶解度的大小而进行相应地调整。在预实验中，按照“2.3”项下的操作，发现正辛醇-水相的比例为1∶5时，水相中药物浓度既可以满足HPLC的测定，又符合药物在油-水混合体系任一相中的浓度不超过0.01 mol·L-1的要求［14］，因此在选择1∶5的比例测定芒柄花素的油水分配系数。另外取水样时，为避免正辛醇的污染，可利用带针头的玻璃注射器来取水样。首先在注射器内吸入部分空气。当注射器通过正辛醇相时轻轻排出空气，在水相中吸取足够的水量后，迅速从溶液中抽出注射器，拆下针头后，即可获得无正辛醇污染的水相［13］。

实验结果显示，pH值对芒柄花素油水分配系数有一定的影响，pH=2.0时，lg Papp=3.23±0.03；pH=8.0时，lg Papp=2.41 ± 0.01。据文献[12]报道，lg P＜-1或lg P＞5的化合物吸收都比较差；-1＜lg P＜5时，可以口服给药且在肠道中较易被吸收；而当药物lg P＜0时，适合血管给药。胃肠道不同部位的pH值分别为胃 1～3，十二指肠 4～6，空肠 6～7，回肠、结肠 7～8［15］。由此可见芒柄花素的水溶性稍提高，其将会在整个胃肠道都有较好的吸收，提示可利用环糊精等材料包合芒柄花素制备芒柄花素的口服制剂，以提高其生物利用度。

平衡溶解度与表观分配系数实验可以较为客观合理地模拟药物在生物体内的水相和生物相之间的分配情况，对于预测药物的渗透性及其生物利用度具有重要意义。芒柄花素在水中几乎不溶，溶解度仅为2.08±0.15μg·mL-1，而其油水分配系数为616.6（lg Papp=2.79）。根据生物药剂学分类系统（BCS）进行分类［16］，芒柄花素属于Ⅱ类低溶解性、高渗透性药物，溶出速率将会成为吸收的限速过程，因此制备芒柄花素口服制剂的关键在于增加药物在体内的溶出度。目前有效改善BCSⅡ类药物的溶出速率的常用方法有：微粉化、晶型修饰、环糊精包合、自乳化或制备成脂质体、固体分散体、纳米乳等剂型。

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Determination of equilibrium solubility and oil/water partition coefficient of formononetin

LIAO Can-cheng1,XU Dan-qiao1,LIU Xiao-hong1,WU Xiu-jun2,HUANG Zexian1,YIJun1,GUOBohong1
（1.School of Pharmacy,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.Guangdong Women and Children Hospitaland Health Institute,Guangzhou 510010,China）

Objective To determine the equilibrium solubility and the apparent oil/water partition coefficient of formononetin for designing new formulations.Methods The mass concentration of formononetin in water or phosphatebuffer with differentpH wasdetected by HPLC,and theshake flaskmethod wasused to determine the apparent partition coefficient of formononetin in n-octanol-water-buffer solutions of different pH.Result The equilibrium solubility of formononetin was 2.079±0.036μg·mL-1 in water at 37℃ and increased with the pH of buffer solution increasing.lg Pappof formononetin was 2.79±0.03 in n-octanol-water system and decreased with the pH of buffer solution increasing.Conclusion Themethods founded in this research can be used to determine accurately the equilibrium solubility and apparent partition coefficient of formononetin,and predict the in vivo absorption and distribution of formononetin.

formononetin;equilibrium solubility;HPLC;partition coefficient

R927

A

1008-0171（2017）06-0071-05

2017-10-20

国家自然科学基金项目（81403111）

廖灿城（1993-），男，广东博罗人，广东药科大学药剂学研究生。

*通信作者：郭波红（1976-），女，湖南长沙人，广东药科大学副教授。

邓军文 dengjunwen69@126.com】