基于指纹图谱结合多元统计分析评价山楂叶质量差异性△

王领弟，臧亚茹，潘伟东，高婧，杜义龙，潘海峰*

(1.承德医学院 附属医院 药学部，河北 承德 067000；2.航天中心医院 临床药理室，北京 100049；3.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

·基础研究·

基于指纹图谱结合多元统计分析评价山楂叶质量差异性△

王领弟1，臧亚茹1，潘伟东2，高婧3，杜义龙3，潘海峰3*

(1.承德医学院 附属医院 药学部，河北 承德 067000；2.航天中心医院 临床药理室，北京 100049；3.承德医学院 河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000)

目的建立山楂叶药材波长变换法HPLC指纹图谱，并用多元统计分析评价山楂叶的差异性。方法采用色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18；流动相为0.5%甲酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)-四氢呋喃(D)混合溶液，梯度洗脱；检测波长为0～15 min，检测波长为260 nm，参比波长为360 nm；15～65 min，检测波长为370 nm，参比波长为430 nm。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A 版)》软件中进行相似度评价，并用SPSS 19.0进行系统聚类分析和主成分分析，根据主成分分析结果再进行聚类分析，筛选出可能影响山楂叶药材差异的指标性成分。结果山楂叶经聚类分析分为三大类，初步确定了山楂叶差异的8个指标性成分。结论本方法快速、准确，适用于山楂叶差异性的评价。

山楂叶；指纹图谱；主成分分析；聚类分析

山楂叶为蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br.或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥叶[1]，主产于河北、山东、河南、山西、广西、辽宁等地[2-3]，主要含有黄酮、有机酸、微量元素、含氮化合物等类成分[4-6]，其中黄酮类是山楂叶生理活性的主要成分[7-9]，临床上主要用于气滞血瘀、胸痹心痛、胸闷憋气、心悸健忘、眩晕耳鸣和高脂血症[1]。

目前对山楂叶的研究多为单一波长[10-11]，且化学成分的研究多采用分光光度法、高效液相色谱法等对单一或多个成分进行定性或定量测定[12-14]，没有对山楂叶药材质量差异的相关性成分的研究。随着现代数据挖掘技术的发展，指纹图谱结合多元统计分析已用于中药材的质量评价[15]。本课题组前期对山楂叶进行了多组分含量测定[16-17]和指纹图谱研究[18-19]，本文进一步采用波长变换法建立山楂叶指纹图谱，并进行聚类和主成分分析，根据主成分分析结果再进行聚类分析验证，筛选出可能对山楂叶药材质量有影响的指标性成分，从而为山楂叶的全面评价提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100 Series高效液相色谱仪(二元泵、二极管阵列检测器)；Agilent Chemstation色谱工作站(美国安捷伦)；HC-2062高速离心机(科大创新股份有限公司)；AG-245型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多)。

1.2 材料

对照品牡荆素鼠李糖苷(批号：151024，纯度>98%)，和牡荆素葡萄糖苷(批号：151103，纯度>98%)购自上海融禾医药科技有限公司；对照品牡荆素(批号：111687-200602)、金丝桃苷(批号：111521-201004)、芦丁(批号：100080-200707)、绿原酸(批号：110753-200413)和槲皮素(批号：100081-200907)，购自中国食品检定研究院，纯度均>99%。甲醇、乙腈为色谱纯(Fisher Scientific，USA)，四氢呋喃为色谱纯(Mreda Technology Inc，USA)；水为娃哈哈纯净水(河北省高碑店市经济开发区)；其他试剂为分析纯。

药材：18批山楂叶药材由承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科植物山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥叶，样品编号及产地分别为：S1产地为四川，S2～S7产地为辽宁，S8～S9产地为山西，S10产地为河南，S11～S14产地为河北，S15～S18产地为山东。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.5%甲酸(A)-乙腈(B)-甲醇(C)-四氢呋喃(D)，梯度洗脱，洗脱程序见表1；检测波长：0～15 min，检测波长为260 nm，参比波长为360 nm；15～65 min，检测波长为370 nm，参比波长为430 nm；流速：1.0 mL·min-1，柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序 %

2.2 溶液制备

对照品溶液制备：精密称取各对照品适量，用甲醇制成每1 mL含牡荆素葡萄糖苷0.60 mg、牡荆素鼠李糖苷1.00 mg、牡荆素0.3 mg、芦丁0.08 mg、金丝桃苷0.3 mg、绿原酸0.4 mg、槲皮素0.04 mg的混合对照品溶液，备用。

供试品溶液的制备：将山楂叶去除杂物后，于烘箱内60 ℃干燥至恒重(约3 h)，用粉碎机粉碎，过60目筛，取山楂叶细粉约1 g，精密称定，置索氏提取器中，加入80%甲醇水提取6 h，蒸干，用甲醇水复溶于10 mL容量瓶中，离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 山楂叶指纹图谱的建立

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1精密度试验 按2.2项下方法制备编号为S1的山楂叶供试品溶液，连续进样6次，按2.1项下色谱条件进样测定，考察各共有峰相对保留时间和相对峰面积。结果相对保留时间的RSD<1.2%，相对峰面积的RSD<1.5%，表明精密度良好。

2.3.1.2 重复性试验 取编号为S1的山楂叶，按2.2项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样，结果各共有峰相对保留时间的RSD<1.5%，相对峰面积的RSD<1.8%，表明重复性良好。

2.3.1.3 稳定性试验 取编号为S1的山楂叶，按2.2项下方法平行制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，结果各共有峰相对保留时间的RSD <1.6%，相对峰面积的RSD<2.3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.2 山楂叶指纹图谱及相似度的评价结果

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2004A版)以中位数法生成其对照图谱，设定S1为参照图谱，采用平均数法，将其他样品的色谱峰与参照图谱进行自动匹配，共标定出10个共有峰，以9号峰金丝桃苷为参照峰，分别计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积。经与对照品比对，共指认出7个色谱峰，色谱图见图1、2和3。S1～S18批山楂叶的相似度结果分别为0.938、0.985、0.987、0.982、0.984、0.981、0.982、0.986、0.982、0.836、0.991、0.994、0.997、0.992、0.990、0.998、0.995、0.998。相似度结果表明，18批山楂叶的相似度存在一定的差异，S10河南产山楂叶相似度匹配结果较低，S1～S9相似度在0.938～0.987，S11～S18相似度均在0.990以上，需要做进一步的多元统计分析以探究不同产地山楂叶差异的原因。

注：1.绿原酸；2.牡荆素葡萄糖苷；3.牡荆素鼠李糖苷；4.芦丁；5.牡荆素；6.金丝桃苷；7.槲皮素。图1 混合对照品溶液色谱图

图2 18批山楂叶HPLC叠加色谱图

注：1.绿原酸；2.牡荆素葡萄糖苷；4.牡荆素鼠李糖苷；6.芦丁；8.牡荆素；9.金丝桃苷；10.槲皮素。图3 山楂叶指纹图谱及共有峰的标定

2.4 多元统计分析

2.4.1 聚类分析 系统聚类分析是根据事物本身的特征研究个体分类的模式识别方法[20]。对18批山楂叶进行指纹图谱分析后共标定出10个共有峰，以10个共有峰的峰面积为变量，运用SPSS 19.0软件以平方Euclidean距离为度量标准，采用组间联接的方法对18批山楂叶样品进行系统聚类分析，结果见图4。当类间距介于5～10时18批样品被分为三大类，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9聚为第Ⅰ类，S10为第Ⅱ类，S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17和S18为第Ⅲ类。聚类分析结果与样品相似度评价结果基本一致，二者可相互印证。

图4 山楂叶聚类分析的树状图

2.4.2 主成分分析 主成分分析主要是利用降维的思想，从多个变量间的联系入手，将多个变量转化为少数几个但能反映原始变量信息的统计分析方法，在指纹图谱研究中有简明、准确的优点[21]。本研究以10个共有峰的峰面积为变量，运用SPSS19.0统计学软件进行主成分分析，首先对共有峰峰面积进行标准化处理，计算成分特征值、贡献率及累计贡献率、初始因子载荷矩阵，得到主成分得分平面图，见图5。

图5 山楂叶主成分分析得分平面图

由主成分的贡献率可知，主成分1的贡献率最大为63.492%，主成分2的贡献率为22.411%，二者累计贡献率达到85%以上，即前2个主成分能解释原变量信息的85%以上，系统自动提取前2个特征值大于1的主成分，可用这2个主成分新变量代替原有的10个变量。

初始因子载荷矩阵中的数据除以主成分对应的特征值开平方根便得到2个主成分中每个指标对应的系数。经计算得出2个主成分的表达式为：

F1=0.018X1+0.363X2+0.334X3+0.377X4+
0.256X5+0.239X6+0.355X7+0.346X8+
0.336X9+0.365X10

(1)

F2=0.617X1+0.158X2-0.116X3-0.184X4-
0.37X5+0.459X6+0.218X7-0.259X8+
0.257X9-0.136X10

(2)

由表达式可知，贡献率最大的主成分1中系数较大的为X2、X4、X7、X8、X9、X10，主成分2中系数较大的为X1和X6，说明峰1、2、4、6、7、8、9、10的量是影响山楂叶差异的主要成分。以这8个峰的峰面积为变量，运用SPSS19.0软件以平方Euclidean 距离为度量标准，采用组间联接的方法再次进行系统聚类分析，结果见图6。结果表明，S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8和S9聚为一类，S10为一类，S11、S12、S13、S14、S15、S16、S17和S18为一类，经主成分分析结果筛选出的数据再进行聚类分析，与之前聚类分析结果基本一致，由此得出，通过多元统计分析可初步筛选出山楂叶的差异指标性成分，分别为1号峰(绿原酸)、2号峰(牡荆素葡萄糖苷)、4号峰(牡荆素鼠李糖苷)、6号峰(芦丁)、7号峰(未知)、8号峰(牡荆素)、9号峰(金丝桃苷)和10号峰(槲皮素)。

图6 山楂叶经过主成分分析后的聚类分析树状图

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本实验对水-甲醇、水-乙腈、甲酸水-乙腈、甲酸水-乙腈-四氢呋喃、乙酸水-乙腈-四氢呋喃、甲酸水-乙腈-甲醇-四氢呋喃等流动相系统进行了比较筛选，同时对不同的色谱柱进行了试验筛选，结果以Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)为色谱柱，以0.5%甲酸水-乙腈-甲醇-四氢呋喃为流动相，各峰的分离度良好，峰高适中。

由于山楂叶指纹图谱中有机酸类先被洗脱，黄酮类后被洗脱，而有机酸类的检测波长一般较低，在200～300 nm的居多，黄酮类的检测波长一般在254 nm或365 nm左右，单一波长紫外检测无法同时有效地检测所有成分，因此为保证指纹图谱的最大信息量化，本研究采取了波长转换的方式，前15 min检测波长为260 nm，参比波长为360 nm；后50 min检测波长为370 nm，参比波长为430 nm。此波长转换法克服了单一波长信息不突出甚至缺失的缺点，最大程度地发挥了紫外检测器的检测效能，有机酸类和黄酮类成分的特征峰均能很好地显现出来，响应值均较强，能更加全面、真实地揭示山楂叶的内在特征。

3.2 多元统计分析

目前，对山楂叶药材的HPLC指纹图谱已有相关报道，但并没有对指纹图谱的数据进行深入挖掘，没有找出隐藏在众多共性下的差异。本研究采用常规的高效液相色谱法，建立山楂叶的指纹图谱，标定出10个共有峰，并根据对照品指认出其中7个，18批山楂叶与对照图谱匹配相似度存在一定的差异。在相似度评价的基础上，本文基于指纹图谱结合多元统计分析对可能影响山楂叶差异的指标性成分进行了初步筛选，首先通过聚类分析将18批山楂叶药材分为3大类，与相似度结果可相互印证。其次，通过主成分分析结合再聚类找出山楂叶药材差异的指标性成分，分别为1号峰(绿原酸)、2号峰(牡荆素葡萄糖苷)、4号峰(牡荆素鼠李糖苷)、6号峰(芦丁)、7号峰(未知)、8号峰(牡荆素)、9号峰(金丝桃苷)和10号峰(槲皮素)，能为进一步研究差异成分与质量的关系提供参考，同时也为制订山楂叶更加合理的质量控制标准提供依据。其中7号峰为未知成分，还需后续研究借助液质联用、核磁共振等手段进一步确认。

3.3 不同产地山楂叶质量差异性

由于不同种植地点的水土、光照等生长环境、栽培及采收加工等因素的影响，导致不同产地的中药材有效成分的种类和含量存在差异，化学多样性更加突出。由相似度结果可知，四川(S1)、辽宁(S2、S3、S4、S5、S6、S7)、山西(S8、S9)产山楂叶样品相似度较高(大于0.930)，反映上述3个产地山楂叶质量较为接近；河北(S11、S12、S13、S14)、山东(S15、S16、S17、S18)产山楂叶样品相似度更高(大于0.990)，反映这两个产地山楂叶质量更为接近；而河南(S10)产山楂叶样品相似度较低，仅为0.836，与前面几个产地山楂叶差异明显。此结果同样可以从聚类分析和主成分分析结果中得到，因此可以认为产地的不同对山楂叶的质量有较大影响。

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EvaluationofDifferenceofHawthornLeafQualityBasedonFingerprintCombinedwithMultivariateStatisticalAnalysis

WANGLingdi1，ZANGYaru1，PANWeidong2，GAOJing3，DUYilong3，PANHaifeng3*

(1.DepartmentofPharmacy，AffiliatedHospitalofChengdeMedicalCollege，Chengde067000，China；2.DepartmentofClinicalPharmacology，AerospaceCenterHospital，Beijing100049，China；3.ChengdeMedicalCollege，HebeiKeyLaboratoryofstudyandexploitationofChineseMedicine，Chengde067000，China)

Objective：The HPLC fingerprint of hawthorn leafs was established by wavelength conversion method，and the differences of hawthorn leafs were evaluated by multivariate statistical analysis.MethodsAn Agilent ZORBAX SB-C18column was used，with the mobile phase of 0.5% formic acid (A) - acetonitrile (B) - methanol (C) - tetrahydrofuran (D) by gradient elution，the detection wavelength were：0-15 min，the detection wavelength was 260 nm，the reference wavelength was 360 nm；15-65 min，the detection wavelength was 370 nm，the reference wavelength was 430 nm.The HPLC fingerprints were obtained and evaluated by Similarity Evaluation System for Chromatographic fingerprint of TCM (2004A edition)，and SPSS 19.0 was used to carry out hierarchical cluster analysis and principal component analysis.According to the principal component analysis，another hierarchical cluster analysis was carried out to screen the possible index compositions that influenced the difference between hawthorn leafs.ResultsThe hawthorn leafs were divided into 3 groups by hierarchical cluster analysis，and 8 index compositions of hawthorn leafs were identified.ConclusionThe method is fast and accurate.It is suitable for the evaluation of the difference of hawthorn leafs.

Hawthorn leaf；fingerprint；principal component analysis；hierarchical cluster analysis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.12.007

河北省中医药管理局项目(2016190)；承德市科学技术研究与发展计划项目(201601A043)

*

潘海峰，教授，硕士生导师，研究方向：中药分析及中药质量评价；E-mail：phf2301@163.com

2017-04-09)