多发性骨髓瘤中Wilms瘤基因（WT1）基因异常甲基化的研究

李 静，王立立，杨 涛，温 丽，李晓红，张倩倩，李 燕*

（1.河北省中医院，河北 石家庄 050011；2.河北省人民医院，河北 石家庄 050057；3.河北省儿童医院，河北 石家庄 050030）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是是常见的血液系统恶性疾病，以中老年患者居多。近年来有研究发现，10%～15%AML患者存在WT1基因突变[1-2]。在探索多发性骨髓瘤患者中发病机制、异常免疫及靶向治疗过程中，WT1的作用越来越受到重视，但其异常甲基化的状态及其影响因素在MM中的作用目前仍不十分清楚，故本研究对MM中WT1甲基化及其表达进行了研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年1月～2017年10月河北省中医院收治的MM患者骨髓标本60例，男32例，女28例，中位年龄68岁（52至79岁）。每例患者均行血常规、骨髓像分析、β-2微球蛋白、生化、免疫球蛋白、血尿免疫固定电泳、影像学检查等，诊断标准参照国内诊断标准，按1975年Duriesalmon分期系统进行分期，其中Ⅰ期15例，Ⅱ期20例，Ⅲ期25例。以同期就诊的30例非恶性血液病患者（主要为缺铁性贫血30例）为对照，缺铁性贫血患者均经详细病史、血常规、贫血三项、血涂片等相关检查确诊。

1.2 研究方法

1.2.1 甲基化分析

使用人淋巴细胞分离液分离标本单个核细胞，提取DNA，进行PCR反应，CpG甲基转移酶修饰阳性对照标本。

1.2.2 MSP产物测序

将MSP扩增产物50 μ送检测序，测序结果运用DNA star软件进行比对分析。

1.2.3 mRNA提取

使用TRI zol法提取单个核细胞总RNA，RNA小量制备试剂盒分离柱纯化RNA，合成cDNA，进行定量PCR反应。

1.3 统计学方法

实验所得数据利用SPSS 20.0统计软件包进行统计分析。甲基化分析采用x2检验，基因表达分析进行正态性检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 甲基化状态

60例多发性骨髓瘤患者中检出WT1基因启动子区甲基化阳性率为21.66%（13/60）；30例对照组WT1基因甲基化阳性率为0.00%（0/30），二者对比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 MSP产物测序结果

多发性骨髓瘤患者在WT1基因启动子区MSP产物检出19处碱基发生CT转换。

2.3 mRNA表达结果

MM患者WT1mRNA表达情况：MM组：（12.39±18.32）Fold，对照组：（13.51±26.38）Fold，MM组与对照组之间比较，差异无统计意义（P＞0.05）；甲基化组：（17.00±16.52）Fold，非甲基化组：（16.45±17.97）Fold；组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨 论

多发性骨髓瘤是浆细胞恶性增殖性疾病，以分泌大量异常免疫球蛋白为主要特点，常表现为乏力、骨痛、病理性骨折、肾功能不全等，多发于老年人，为不可治愈性疾病。最早于2003年由Galm等报道了利用MSP技术检测MM中WT1基因异常甲基化的情况，研究证实：35例骨髓瘤患者及U266和XGI骨髓细胞系列WT1启动子区甲基化阳性率为65.71%（23/35），WT1基因异常甲基化能使得该基因沉默。但Melzner等采用Galm等提供的引物却没有得到预期结果。

WT1异常甲基化在MM的发病机制中具有一定作用，其可作为监测多发性骨髓瘤发病与治疗反应的指标之一。WT1基因启动子区甲基化表达在60例多发性骨髓瘤患者中阳性率为21.66%（13/60）；在30例对照组中甲基化阳性率为0.00%（0/30），阳性率低于国外报道，其原因可能为：本实验研究对象多为复发患者。

[1]肖 萌,何 娟,李 艳,等.BD方案与VAD方案治疗多发性骨髓瘤的疗效比较[J].中国医科大学学报,2011,40(4):352-356.

[2]王金行,赵 越,刘柏新,等.血清免疫固定电泳在多发性骨髓瘤诊断中的意义[J].广东医学,2011,32(15):2018-2020.