断体地龙成分分离及促进创伤愈合活性研究

段晓杰，罗世林，王雄飞，杨雨薇，赓迪，赵仁云，郑竹宏，丁玉婷，孙毅坤

(北京中医药大学，北京 102488)

地龙[1]始载于《神农本草经》，又名“蚯蚓”，主要成分有蛋白质、酶类、氨基酸、脂类、核苷酸和微量元素等，具有抗凝血和纤溶、降压、促进创伤修复、平喘及保护肾脏的作用。有学者曾研究地龙的再生过程中三种基因(Pex-lab01，Pex-lab02，Pex-lab03)的表达情况，结果发现只有在地龙尾部断体处理后，Pex-lab01和Pex-lab02的表达呈上调趋势，这表明在早期的地龙再生过程中参与了创伤愈合过程[2]。

课题组前期研究[3]发现,尾部断体三天的地龙提取液能有效促进创伤愈合，本实验通过盐析(饱和硫酸铵法)对提取液进行进一步分离，通过CCK-8法测定其对成纤维细胞增殖作用的影响，从而筛选活性较强的组分。

1 实验材料

1.1 实验仪器

匀浆机(IKAT10 basic)；pHS-3C型酸度计(上海伟业仪器厂)；冷冻离心机(TGL-20M,上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；万分之一天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；洁净工作台(HD-1360，北京东联哈尔仪器制造有限公司)；细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific)；倒置显微镜(OPTEC BDS200，重庆市奥特光学仪器有限责任公司)；离心机(Anke TDL-50B，上海安亭科学仪器厂)；酶标仪(ELX800，湘智离心机厂)。

1.2 实验药材与试剂

Tris(C4H11NO3，AMRESCO)；盐酸(分析纯，北京化工厂)；氯化钠(NaCl，分析纯，北京化工厂)；Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒，日本同仁化学公司)；DMEM培养基(Cellgro公司)；胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)；双抗(北京拜耳迪生物科技有限公司)；0.25%Trypsin-EDTA(GIBCO公司)；硫酸铵((NH4)2SO4，北京化工厂)；25 cm2细胞培养瓶(corning公司)；无菌0.22 μm过滤膜；赤子爱胜蚓(天津市东丽区成功蚯蚓养殖场)；NIH3T3(北京协和细胞资源中心)。

2 实验方法

2.1 盐析样品的制备

在冰浴条件下向地龙粗提液[4]中缓缓加入饱和硫酸铵溶液(实验前用氨水调pH值至7.2)，边加边搅拌，在4℃静置1 h后低温离心15 min，沉淀用Tris-HCl(0.01 M，pH 值7.2)缓冲液溶解，上清液继续盐析。低温透析后依次得到饱和度分别为0～30%(S1)、30%～45%(S2)、45%～60%(S3)、60%～75%(S4)的样品，-20℃保存备用。

2.2 盐析样品活性筛选

NIH3T3采用“速融法”复苏后培养于DMEM高糖培养液中(含10%FBS和1%双抗)。采用Trypan Blue对细胞进行计数后，调整细胞密度，接种于96孔板上，每孔100 μL(约5 000个细胞)，将培养板放到二氧化碳培养箱(5%CO2，37℃饱和湿度)中培养。接种细胞分为给药组(S1组、S2组、S3组、S4组)，阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组只加完全培养液，阳性组加含有bFGF的培养液，另设调零孔，每组设3个复孔。培养24 h后给药，给药后将细胞放入培养箱中继续培养。再过48 h取出培养板，弃去旧的培养液，加入含有CCK-8的培养液(培养液：CCK-8=10∶1)110 μL，加完放入培养箱中孵育1.5 h后，采用酶标仪测定吸光度，计算增殖率。增殖率以阴性对照组为100%计。

2.3 统计学处理

3 实验结果

不同组分在不同浓度下对成纤维细胞的增殖作用见表1。实验结果表明，各实验组细胞增殖率较阴性对照组均有统计学意义。在一定浓度范围内，随着蛋白浓度的增加对细胞的增殖作用也越来越强。S1、S3和S4组在蛋白浓度为6 μg/mL时增殖率达到最大值，分别为113.62%、117.03%和111.26%；而S2组在蛋白浓度为8 μg/mL时达到最大值，为108.58%。

表1 不同盐析组分对NIH3T3增殖率的影响

注：与阴性对照组比较，*P<0.05

根据表1绘制各组细胞增殖率曲线，见图1。由图1可看出，在一定的蛋白浓度范围内，细胞增殖率随着蛋白浓度增加呈依赖上升趋势，当达到某一浓度后，细胞增殖率开始降低，甚至出现高浓度抑制生长现象。四组相较，S3促进NIH3T3增殖作用更趋于稳定，且增殖率也相对较大。

图1 不同盐析组分促进NIH3T3细胞的增殖率曲线

4 讨论

创伤修复过程中，多种生长因子、细胞及细胞外基质相互作用，形成一个复杂的修复机制[5]。创伤愈合大致分为四个阶段：止血和炎症反应阶段、细胞增殖与新生血管阶段、成纤维细胞与肉芽组织形成阶段和组织重塑阶段[6]。成纤维细胞增殖是在创伤修复的第二天开始的，是创伤修复的主要过程之一[7]，因此本实验以药物对成纤维细胞增殖作用的影响作为判断评价创伤愈合情况的依据。

本实验将断体地龙提取液通过盐析分离得到S1、S2、S3和S4，通过测定给药后成纤维细胞的增殖率，发现四种成分均对成纤维细胞有促进增殖的作用。但四组相较，S3组细胞增殖作用最强，且活性蛋白浓度范围更广泛。但本实验仅以促进成纤维细胞的增殖作用作为筛选指标，不能充分说明其对创伤愈合的作用，因此实验后期将以小鼠为研究载体建立在体创伤模型，对各组分进行进一步筛选验证，从而阐明断体地龙提取液促进创伤愈合的物质基础。

[1] 唐鼎,凃乾,李娟,等.药用地龙的药理作用和临床研究进展[J].中国药师,2015,18(6):1016-1019.

[2] Sungjin C,Kiseok K,Eun L,et al.Differential expression of three labial genes during earthworm head regeneration[J].Bioscience Biotechnology &Biochemistry,2009,73(12):2609-2614.

[3] 汪文琪,胡海聪,张志千,等.断体地龙提取液促进小鼠创伤愈合作用研究[J].世界科学技术-中医药现代化,2015,17(7):1449-1453.

[4] 胡海聪,李翠芬,张硕峰,等.断体地龙再生期提取液对成纤维细胞增生作用的研究[J].中华中医药学刊,2013,31(5):1126-1128.

[5] 阚成国,许树军,杨若娅,等.珍珠散对急慢性创面组织修复及碱性成纤维生长因子影响的实验研究[J].中医药信息,2015,32(1):37-39.

[6] 刘怀金,方彩华.运动创伤皮肤伤口愈合机制研究[J].体育科技文献通报,2012,20(5):19.

[7] 秦全红.成纤维细胞在皮肤创伤愈合中的作用及其调控[J].国外医学(创伤与外科基本问题分册),2000,27(1):33-36.