健脾益肾、祛瘀化浊法对糖尿病肾病大鼠肾脏保护作用的研究

曹拥军 徐作俊 陈亚琴

摘要：目的 探討健脾益肾、祛瘀化浊法对糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏的保护作用及机制。方法 链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病肾病大鼠模型，随机分为降糖精低剂量组、降糖精中剂量组、降糖精高剂量组，ACEI组（阳性对照治疗组）各16只，另以16只正常大鼠作为正常组。降糖精颗粒低、中、高剂量组分别灌胃给予降糖精颗粒9 g（生药量）/kg，18 g（生药量）/kg和36 g（生药量）/kg，1次/天；ACEI组给予贝那普利（1 mg/kg·d-1）灌胃，糖尿病肾病模型组及正常组给予0.9%NaCl溶液灌胃。共观察8周，检测各组8周末24h尿微量白蛋白定量、肾重/体重、肾功能（Scr、BUN），免疫组织学检测。结果 与正常对照组比较，模型组大鼠血糖明显升高（P<0.05），体质量明显下降（P<0.05），肾质量、肾质量/体质量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，降糖精各剂量组及ACEI组大鼠空腹血糖明显降低（P<0.05），体质量明显高增加（P<0.05），肾质量、肾质量/体质量明显降低（P0.05）。与正常对照组比较，模型组大鼠UAER、BUN 和Scr水平均明显增高，差异有统计学意义（P0.05）。由Western blot结果看出，模型组大鼠肾组织CTGF和VEGF含量高于正常组；降糖精各剂量组及ACEI组大鼠肾组织CTGF和VEGF含量均低于模型组；降糖精剂量升高，CTGF和VEGF表达降低。结论 健脾益肾、祛瘀化浊法能明显改善大鼠肾脏功能，其机制可能与抑制CTGF、VEGF的表达有关。

关键词：糖尿病肾病；降糖精颗粒；大鼠；健脾益肾、祛瘀化浊法

中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2018）11-0066-03

【Abstract】Objective： To study the protective effect and mechanism of spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method on kidney in diabetic nephropathy （DN） rats. Methods： Rat models of diabetic nephropathy induced by streptozotocin （STZ） were randomly divided into low， medium and high dose groups of Jiangtangjing granules， and ACEI group （positive control group）， 16 rats per group. Another 16 normal rats were used as the normal group. The low， medium and high doses of Jiangtangjing granule groups were administered intragastrically with granules 9 g （raw dose）/kg， 18 g （raw dose）/kg and 36g （raw dose）/kg， once a day. The ACEI group was administered with benazepril （1 mg/kg·d-1）， and the diabetic nephropathy model group and the normal group were administered with 0.9% NaCl solution. The observation lasted 8 weeks. The 24-hour urine microalbumin quantitation， kidney weight/body weight， renal function （Scr， BUN） of each group were detected by immunohistochemistry at the end of the 8th week. Results： Compared with that of the normal control group， the blood glucose of the model group significantly increased （P0.05）. Compared with that of the normal control group， the levels of UAER， BUN and Scr of the model group significantly increased， and the difference was statistically significant （P0.05）. The results of Western blot showed that the levels of CTGF and VEGF in the renal tissue of the model group were higher than those in the normal group. The contents of CTGF and VEGF in the renal tissue of the Jiangtangjing groups and the ACEI group were lower than those in the model group. With the increase of Jiangtangjing doses， the expression of CTGF and VEGF deceased. Conclusion： The spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method can improve the kidney function of rats， and its mechanism may be related to the inhibition of CTGF and VEGF expression.

【Key words】diabetic nephropathy， Jiangtangjing granules， rats， spleen-invigorating and kidney-nourishing and blood stasis-eliminating and turbid substance-removing method

糖尿病肾病又称糖尿病肾小球硬化症，是糖尿病最常见的、严重的慢性微血管并发症，是糖尿病致死致残的主要原因之一。在西方国家已成为终末期肾病（ESRD）的第一位因素[1]。国内，约55%的DM患者尿检尿蛋白阳性，当患者出现临床蛋白尿约7年内有50%进入终末期肾病（ESRD），大多数患者最终将不可避免的需要行肾透析和肾移植治疗[2]。因此探求DN的发病机制，寻找有效防治并逆转DN进展的药物，已经成为一个迫在眉睫的社会问题。迄今，尚无有效西药能阻止糖尿病肾病肾功能损害的自然进程，而近年来，中医药在防治糖尿病及其并发症方面，虽不具系统性，但已显示出独特的优势，在延缓病情进展及控制疾病的恶化等方面，取得了较为满意的结果。因而中医药对糖尿病肾病的治疗蕴含了广阔的前景。降糖精颗粒为南通市中医院院内制剂，其临床用于防治早中期糖尿病肾病已有多年，且取得了较好疗效。在已有临床研究的基础上，我们通过制备糖尿病肾病实验大鼠模型，观察降糖精颗粒对糖尿病肾病大鼠影响，验证其疗效及探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级SD大鼠，雌雄兼用，体质量180-220 g，由昆明医学院动物试验中心提供，许可证号为SCXK（滇）2014—0014。

1.1.2 药物 降糖精颗粒由南通市中医院制剂中心生产，10 g/袋，（批准文号：苏药制字Z04001366）；盐酸贝那普利购自北京诺华制药公司，5 mg/片，（批准文号：X0305）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与造模 健康SD大鼠，适应性喂养一周后，腹腔一次性注射链脲佐菌素（50 mg/kg体重），48 h后尾静脉采血，用快速血糖仪测定全血血糖，血糖>16.7 mmol/L者确定为糖尿病模型成功；随机分为病理模型组，阳性药组，降糖精颗粒低、中、高剂量剂量组，另设一组为正常对照组，每组16只。

1.2.2 给药方法 病理模型组和阳性药组分别以生理盐水和贝那普利组（1 mg/kg·d-1）灌胃，降糖精颗粒低、中、高剂量组分别灌胃给予降糖精颗粒9 g（生药量）/kg，18 g（生药量）/kg和36 g（生药量）/kg，1次/天，给药量按照实验动物与人用药量的换算公式计算得出。持续8周。

1.2.3 标本收集 灌胃给药的第4和第8周分别处死8只大鼠。处死前心脏穿刺取血标本，血清测血肌酐、总蛋白、白蛋白等。取左、右肾组织，左肾组织以10%中性福尔马林固定，石蜡包埋；右肾组织液氮冷冻，-80℃保存。

1.2.4 肾脏指数计算 肾脏指数（RI）=左肾质量（LRW）/大鼠体质量（BW）×100。

1.2.5 肾功能测定 血清尿素氮（BUN）、肌酐（Ccr）、尿酸（UA）采用7060Hitachi 全自动生化分析仪测定。

1.2.6 尿白蛋白含量测定 采用放射免疫法测定。

1.2.7 Western blot 取适量肾组织，加入细胞裂解液（RIPA：PMSF：蛋白酶抑制剂：磷酸酶抑制剂=100：1：1：1）并匀浆，离心后取上清作为蛋白提取液。通过Western blot法对蛋白提取液进行凝胶电泳，将蛋白转印至PVDF膜上，分别孵育CTGF、VEGF和GAPDH一抗及二抗，化学发光法显色，观察条带；Western blot由云南省中医医院中心实验室完成。

1.3 统计学方法 采用SPSS16.0软件进行统计学处理。均数比较采用方差分析（ANOVA），P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般状况 实验期间正常组大鼠体质量增加明显，毛泽光滑，精神状态良好，反应灵敏，动作自如。模型建立成功后，模型组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、消瘦以及反应迟钝、毛发枯黄、尾巴苍白湿冷、精神萎靡等现象。用药4周后，降糖精各剂量及ACEI组大鼠精神、进食量、饮水量、尿量有所改善；用药8周后上述现象逐渐恢复正常，与模型组大鼠比较毛色明显转好，体质量增加，自主活动亦明显改善。

2.2 各组大鼠血糖、体质量、肾质量和肾质量/体质量 与正常对照组比较，模型组大鼠血糖明显升高（P<0.05），体质量明显下降（P<0.05），肾质量、肾质量/体质量明显增加（P<0.05）；与模型组比较，降糖精各剂量组及ACEI组大鼠空腹血糖明显降低（P<0.05），体质量明显高增加（P<0.05），肾质量、肾质量/体质量明显降低（P0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠UAER、BUN 和Scr水平 与正常对照组比较，模型组大鼠UAER、BUN 和Scr水平均明显增高，差异有统计学意义（P0.05）。见表2。

2.4 各组大鼠肾组织CTGF和VEGF的表達 由Western blot结果看出，模型组大鼠肾组织CTGF和VEGF含量高于正常组；降糖精各剂量组及ACEI组大鼠肾组织CTGF和VEGF含量均低于模型组；降糖精剂量升高，CTGF和VEGF表达降低。见图1。

3 讨论

糖尿病肾病的发病机制十分复杂，目前尚未完全阐明，但一致认为其发病是由遗传因素和环境因素共同作用的结果。CTGF和VEGF在糖尿病肾病发生发展过程中起着重要作用。CTGF是肾脏纤维化过程中的重要调节因子。有人肾活检标本中CTGF表达显著增高。尤其是肾小球实质细胞，包括肾小球系膜细胞，其升高程度与肾小球硬化呈相关性[3]。由此看来，CTGF在糖尿病肾病的发生发展中有重要作用。VEGF是目前所知的最强的血管通透性因子，与肾小球基底膜（GBM）有很高的亲和力，能引起GBM通透性增加，改变肾脏血流动力学而导致蛋白尿。VEGF参与早期糖尿病肾病的发病机制，VEGF可促进系膜细胞（MC）合成细胞外基质（ECM）。最近的研究显示糖尿病肾病的发生和VEGF在肾组织高表达有关，DM持续的高血糖状态对VEGF表达具有上调作用，机制可能是高糖引起细胞缺氧致VEGF表达上调，已知缺氧是VEGF最强的刺激因素。

古代医家对糖尿病肾病早就有认识，根据临床表现不同的症状，分属中医“消渴”、“水肿”、“尿浊”、“癃闭”、“虚劳”、“溺毒”等范畴。中医文献中虽无糖尿病肾病这一名称，但对本病的临床表现早有记载，如《圣济总录》云：“消渴病久，肾气受伤，肾主水，肾气虚衰，气化失常，开合不利，水液凝聚体内而出现水肿。”明代《证治要诀》云：“三消久而小便不臭，反作甜气，在溺中滚涌，更有浮溺面如猪脂，此精不禁，真元竭也。”指出了消渴日久并发新症，病情加重，致使真元竭，预后不佳。由于气虚不能帅血而行，阳虚寒凝血滞，阴虚火旺煎灼津液，均可导致瘀血痰浊的形成。气阴双亏，痰浊瘀血痹阻脉络是消渴病发生并发症的病理基础。糖尿病肾病为消渴日久，缠绵不愈，使脏腑功能失调，阴阳气血虚衰而发病.，糖尿病肾病病理特点为本虚标实，虚实夹杂，虚在脾肾、实在瘀血浊毒。《景岳全书.肿胀》：“凡水肿等症，乃肺脾肾三脏相干之病，盖水为至阴，故其本在肾，其标在肺，水唯畏土，故其制在脾。”说明本病初期以肺、脾、肾虚损为主，因肺、脾、肾虚损，导致湿浊毒邪内蕴，进而弥漫三焦，阻遏气机，气滞则血瘀，加之气虚无力运血，终致瘀血内生。“浊毒”和“阏血”进一步加重脏腑的损害，形成正虚邪实互为因果的病因病机特点。针对病因病机，治疗应以活血化淤，排毒泄浊，健脾益肾为主。故《内经》云：“治病必求于本”。所以健脾益肾，祛瘀化浊是其根本治法。降糖精颗粒是本院内分泌科经长期临床实践总结的治疗糖尿病肾病的结晶。其方中黄芪为君，升清阳，補肺气，布精微，为补气升阳之要药，气旺则阴津得以化生，津液生则渴可止；臣以制黄精、薏苡仁、葛根清热滋阴，生津润燥而止渴；佐以生山楂、水蛭、白芥子祛瘀通络；使以山药三焦并理，能助诸药上补肺金生津止渴、中健脾胃输布津液，下补肾元而缩尿涩精。诸药合用，标本兼顾，共奏健脾益肾、祛瘀化浊之功效。

总之，在糖尿病肾病大鼠模型中，降糖精颗粒对缓解肾脏损害、保护肾脏有确切的疗效，其作用除与降低血糖、改善肾功能、减少尿蛋白有关外，可能还与下调CTGF、VEGF表达以防治肾脏纤维化的作用有关。

参考文献：

[1]Collins AJ，Kasiske B，Herzog C，et al.Excerpts from the United States Renal Data System 2003 Annual Data Report：atlas of end-stage renal disease in the United States.Am J Kidney Dis.2003；42（6S5）：A5-7.

[2]Lin Shanyan.Nephrology in China：A great mission and momentous challenge.Kidney int.2003；63（S83）：S108-S10.

[3]Suzuki D，Toyoda M，Umezono T，et al.Glomerular expression of connective tissue growth factor mRNA in various renal disease[J].Nephrolodgy，2003，8（2）：92-97.

（收稿日期：2018-05-24）