Rab27a基因与外泌体的研究进展①

王小霞，陈煜森，马晓瑭，潘群文，黄子慧

1.广东医科大学附属医院神经内科，广东湛江市524002；2.广东医科大学附属医院神经病学研究所，广东湛江市524000

Rab27a基因位于15号染色体的反义链上(15q21)，所编码的蛋白是参与真核细胞中各种囊泡对接、分泌、运输和融合的鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate,GTP)酶蛋白家族的重要成员[1]。

1 Rab27a基因概述

1.1 克隆、表达及效应蛋白

Rab蛋白家族的成员是Ras超家族的非转化单体GTP结合蛋白，其含有涉及GTP结合和水解的4个高度保守区域。Rabs是膜结合蛋白参与囊泡融合和运输的重要参与者。与其他Rab蛋白相似，Rab27a在GTP结合的活性状态和鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate,GDP)结合的非活性状态之间循环。Rab27a在其C端的两个保守半胱氨酸残基处发生异戊二烯化，这种修饰在囊泡运输过程中可将Rab27a锚定到膜上。这是Rab27a参与真核细胞中囊泡和细胞器的靶向对接融合的基础[1]。研究表明，通过保守Rab蛋白GTP结合结构域的2个序列的简并寡核苷酸引物对人黑色素瘤细胞cDNA进行PCR，能够分离编码Rab27a和Rab27b的cDNA[2]。序列比较显示，Rab27b是与Rab27a在氨基酸水平上具有71%同一性的同系物[3]。

Rab27a作为Rab家族中的一类Ras小GTP酶，广泛参与调控真核生物的细胞内膜运输，其功能的发挥往往都需要Rab27a效应蛋白的参与。到目前为止，已经在人类和小鼠中鉴定了11种与Rab27的GTP结合形式特异性作用的不同Rab27效应物，主要包括以下三组。第一组包含突触结合蛋白样蛋白(Slps)和rabphilin(Rab结合蛋白)，其特征在于N-末端Rab27-结合Slp同源结构域(SHD)和C末端串联C2结构域。第二组含有Slac2(缺少C2结构域的Slp同源物)和Noc2(Rab结合蛋白)。两者都含有N-末端SHD但缺少C2结构域。第三组仅包含Munc13-4(Rab结合蛋白)，含有两个独立的C2结构域和不同于SHD的Rab27结合位点[4]。

1.2 Rab27a基因功能

脉络膜缺失症(choroideremia,CHM)是一种X连锁的视网膜退行性疾病，由Rab Escort蛋白1(Rab Escort protein 1,REP1)突变引起。REP1在Rab GTP酶的异戊烯化中起作用，Rab GTP酶是细胞内蛋白质传递的调节剂。Rab27a在Rabs中是独特的，因为它在CHM细胞中会被选择性地非甲基化，这表明CHM中的退化过程可能是由于Rab27a的非甲基化和随后的功能丧失所致[5]。在Rab27a敲除小鼠的视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)中，黑素体不能移出黏附连接轴并且不能进入RPE光感受器顶端，这表明Rab27a调节RPE中的黑素体分布[6]。使用小鼠RPE原代培养的活细胞成像来研究黑素体动态，结果表明与皮肤黑素细胞不同，Rab27a的作用是通过Rab27a-Myrip-MyoVIIa复合物(MYRIP、Rab27a效应蛋白、MyoVIIa，肌球蛋白)调节黑素小体束缚到肌动蛋白丝上，该过程确保黑素体向细胞周边移动[7]。

在皮肤黑素细胞中，Slac2-a/黑素蛋白在成熟黑素体上和基于肌动蛋白的运动肌球蛋白Va之间形成桥接，并且所得到的三联蛋白复合物促进黑素体从微管转移至肌动蛋白丝，参与黑素体运输[8]。Melanophilin(Mlph)是一种与Rab27a-和肌球蛋白Va(MyoVa)结合的蛋白，也可调节黑色素细胞中黑素体转运这一过程。通过干预Mlph与Rab27a和MyoVa相互作用，可挽救黑素体运输缺陷[9]。

此外，Rab27a还可以调节溶酶体相关细胞器(lysosome-related organelle,LRO)的转运和分泌颗粒在各种类型的细胞中的释放。LRO包括黑素细胞中的黑素体、淋巴细胞中的溶解颗粒、血小板中的δ颗粒和破骨细胞中的“分泌”溶酶体("secretory"lysosomes in osteoclasts,OCL)。Rab27a 基 因 敲 除 灰 鼠(Ashen鼠)OCL显示，骨吸收活性异常和溶酶体定位明显减少，表明Rab27a缺陷导致OCL中LRO的异常转运[10]。有研究表明，Rab27a可促进自然杀伤细胞(natural killer cell)早期脱颗粒，并且不同的NK细胞活化受体优先将Rab27a或Munc13-4募集到含有穿孔素的颗粒中以获得细胞毒性，突出了Munc13-4和Rab27a之间的脱颗粒相互作用[11]。在细胞溶胶和未受刺激的NK细胞的质膜中，大部分裂解颗粒(lytic granule,LG)是可移动的。研究表明，细胞溶胶中的LG运动需要微管而不是肌动蛋白，而在质膜上的运动则需要微管和肌动蛋白。在质膜上，Rab27a缺陷会使可移动LG比例减少，而在细胞溶胶中，Rab27a缺陷却可以增加可移动LG比例，增加它们的运动程度[12]。

研究表明，趋化因子CCL5是第一个涉及调节抗肿瘤免疫反应的趋化因子之一。Rab27a或hMunc13-4的缺陷可消除T淋巴细胞分泌颗粒(cytotoxic T lymphocyte cytotoxic granules,CG)胞吐作用和CCL5的突触分泌。细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)是通过将CCL5储存在不同于CG的T细胞质囊泡(CTL store CCL5 in cytoplasmic vesicles,CCL5V)中，并且与靶细胞，如肺肿瘤细胞，在免疫突触(immunological synapse,IS)的Rab27a-hMunc13-4隔室合并，同时触发CG胞吐以及CCL5突触分泌的[13]。而CTL裂解颗粒向免疫突触的终端转运则由驱动蛋白-1/Slp3/Rab27a复合物介导[14]。此外，Rab27a介导的CTL中溶解颗粒分泌也是免疫突触处皮质肌动蛋白功能恢复所需的[15]。

在病毒感染方面，Rab27a能通过促进包膜蛋白的细胞表面转运促进人类parain流感病毒2型的生长[16]。Rab27a可通过指导磷脂酰肌醇4-激酶2型(PI4KII)阳性内涵体向病毒多蛋白Pr55质膜(PM)转运从而控制HIV-1的复制[17]。在Rab27a沉默细胞中单纯疱疹病毒感染少突胶质细胞数量和病毒产量显著降低[18]。

1.3 基因结构

Rab27a基因包含5个编码外显子和2个非编码外显子，其中一个可交替使用，并且跨越约65 kB的DNA。在长3'UTR区域中有3个可选择的poly-A加成位点，还有6个潜在的单核苷酸多态性。通过荧光原位杂交确定该基因位于染色体15q15-21.1上，并通过辐射杂交作图定位于标记D15S209和AFM321ZD5之间[5]。

1.4 遗传学特征

Griscelli综合征2型(Griscelli syndrome 2,GS2)是由Rab27a基因突变引起的一种常染色体隐性遗传疾病，其临床特征为部分白化病和嗜血细胞性淋巴细胞增多症(hemophagocytic lymphohistiocytosis,HLH)，免疫异常则表现在以细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞裂解活性受损为主。造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是GS2的唯一治愈性治疗[19]。

1.5 动物模型

与GS2型患者相对应的小鼠模型Ashen鼠存在Rab27a基因突变，灰色表型也是由于黑色素在黑素细胞的核周区域中积聚，损害了这些颗粒向角质形成细胞转移，因此导致色素沉着不足，毛发灰色，免疫学特征包括对重复感染的易感性和T细胞细胞毒性活性的缺乏[20]。

研究表明，Ashen鼠存在血小板缺陷，可导致出血时间增加和血小板致密颗粒数量分泌减少或基本正常，但颗粒内部是异常的。胶原介导的Ashen鼠血小板的聚集能力明显抑制。其他2种主要血小板颗粒，溶酶体和α颗粒，其浓度或分泌率无明显异常[21-22]。

Rab27a在胰岛中高度特异性地表达，在胰腺β细胞中，高葡萄糖刺激下，Rab27a介导胰岛素颗粒与质膜的紧密对接。Ashen小鼠显示葡萄糖不耐受，外周组织没有胰岛素抵抗的迹象或胰腺中的胰岛素缺乏。在Ashen小鼠胰岛中，胰岛素颗粒在质膜上的对接和在葡萄糖刺激期间对接颗粒的补充显著减少[23]。

还有研究表明，Ashen鼠表现出低繁殖力，Rab27a不参与卵母细胞成熟，但在调控皮质颗粒(cortical granule,CG)胞吐方面发挥重要作用，在小鼠卵母细胞的孤雌激活剂氯化锶(strontium chloride,SrCl2)孤雌激活后，Rab27a RNAi或抗体注射卵母细胞则不能进行CG胞吐作用[24]。

2 Rab27a基因与多种疾病的关联性

Rab27a基因位于染色体15q15-21.1上，研究表明，Rab27a蛋白在造血谱系、脾脏、肺、眼睛、胰腺和胃肠道中广泛表达。其他组织如肝脏、心脏、肌肉、睾丸和脑组织在正确组织灌注时则Rab27a的表达比较少[25]。大量证据显示，Rab27a基因广泛参与癌症、炎症、血栓形成等疾病的发生发展。

2.1 Rab27a与癌症及血管形成

研究表明，Rab27a表达水平降低会削弱血管内皮生长因子受体-1(vascular endothelial growth factor,VEGFR1)的棕榈酰化，降低其稳定性，使血管萌芽和体内血管生成增加[26]。Rab27a基因还能对多种肿瘤的迁移和侵袭等特性产生重要影响，在结肠癌组织和细胞系中，Rab27a过表达时miRNA-582-5P表达下调，而过表达miR-582-5P能够通过靶向抑制Rab27a从而抑制结肠癌细胞的侵袭能力[27]。在脑胶质瘤中，Rab27a在胶质瘤中的表达高于正常脑组织，且其表达随着胶质瘤级别进展而增加[28]，Rab27a可以促进胶质瘤细胞的增殖和侵袭，抑制细胞凋亡[29]。在胰腺癌中，Rab27a下调能增强对顺铂的敏感性并诱导人转移胰腺腺癌细胞(ASPC-1)的凋亡，降低ASPC-1细胞的侵袭和增殖能力[30]。研究表明，在非小细胞肺癌细胞中干扰Rab27a的表达水平能显著降低肿瘤的增殖和侵袭，促进细胞凋亡，并增加对NSCLC化疗药物的敏感性[31]。很多研究显示，Rab27a在肿瘤中很可能发挥癌基因的作用，抑制Rab27a的表达能够抑制肿瘤的生长。因此Rab27a很可能是治疗肿瘤的有效靶分子。到目前为止，Rab27a在人类癌症中的作用还存在一些矛盾的地方，如与正常组织相比，miR-182-5p在胃癌(gastric cancer,GC)组织中以较高水平表达，而Rab27a在癌组织中以较低水平表达。miR-182-5p的下调和Rab27a的上调可显著降低HGC-27细胞的活力、迁移、侵袭和有丝分裂[32]。这些矛盾的发现表明，Rab27a在特定情况下可能在不同的人类癌症中具有不同的分子机制，这还有待以后进一步探究。

2.2 Rab27a与炎症

中性粒细胞响应各种炎症刺激，可形成嗜中性粒细胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps,NETs)，在宿主防御中起着至关重要的作用，而活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生是NETs形成的关键。研究表明，Rab27a敲除抑制了ROS阳性吞噬体的形成，也抑制血清处理的白色念珠菌以ROS依赖性方式触发的NET形成[33]。一方面，Munc13-4可限制表达Rab27a的囊泡运动性以促进脂多糖诱导的嗜中性粒细胞胞吐作用[34]。另一方面，在脂多糖诱导的系统性炎症模型中，Ashen小鼠对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的死亡具有拮抗性，Ashen小鼠显示LPS施用后显著降低的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)的血浆水平和肝脏中嗜中性粒细胞的浸润，突出了Rab27a在LPS介导的全身性炎症中以前未被认识到的作用[35]。Ashen小鼠的嗜中性粒细胞在体外和体内表现出迁移缺陷[36]。另外，Rab27a敲除也损害了髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)向血浆中的分泌，干扰JFC1/Slp1-Rab27a分泌机制能够减弱透化的嗜中性粒细胞中MPO的分泌[37]。有研究表明，Ashen小鼠在内毒素攻击时显示极低的嗜中性粒细胞分泌蛋白的血浆水平，说明过表达Rab27a可能有利于阻断脓毒症的进展，突出显示Rab27a作为治疗系统性炎症的新型治疗靶标[38]。

2.3 Rab27a与止血和血栓形成

血管内皮细胞含的棒状分泌细胞器，称为Weibel Palade体(Weibel Palade body,WPB)，其含有止血蛋白(VWF)、P-选择素(P-selectin)和炎症介质等混合物[39]。文献表明，Rab27a通过其募集多种效应物的能力，在调节WPB胞吐方面起着特别重要的作用，已经证明Rab27a/MyRIP复合体是外周锚定WPB所必需的。这种锚定提供了对胞吐作用的制动，并且可以防止不成熟/较少的多聚VWF的释放[40]。研究表明，Slp4-a在促进激素激活的WPB胞吐中起关键作用，WPB上的Rab27a-Slp4-a复合物通过与突触融合蛋白结合蛋白1(syntaxin-binding protein 1,SPXBP1)相互作用促进胞吐，从而控制脉管系统中血管活性物质的释放[41]。虽然血小板还含有Rab27b，可以补偿灰鼠中血小板Rab27a缺陷的功能[3]。但是，最近的研究显示，Ashen小鼠出现血小板聚集功能降低，出血时间延长和血小板致密颗粒分泌数量减少[21]，而Rab27a调节血小板中致密颗粒的分泌机制是通过其效应蛋白Munc13-4实现的[42]。虽然目前还没有文献显示Rab27a与止血和血栓形成直接相关，鉴于Rab27a基因与血小板致密颗粒分泌过程以及血管内皮细胞关系密切，推测Rab27a调节血小板致密颗粒的分泌异常极有可能是通过调节血小板功能或其活化后产生的微囊泡等的释放作用，从而影响血管内皮细胞的功能以及调节止血和血栓形成等过程。

3 Rab27a基因与外泌体

3.1 Rab27a基因调节外泌体的分泌

外泌体是细胞内在内吞多泡室中形成的小囊泡(直径50～100 nm)，由大多数细胞类型分泌，包括肿瘤和免疫细胞等。外泌体携带了许多生物活性蛋白和核酸，可通过多膜晚期内涵体(multivesicular late endosomes,MVEs)与质膜融合而分泌，参与细胞间通讯、传染病和退行性疾病等的发病机制。肌动蛋白细胞骨架调节蛋白(an actin-binding protein,coronin)控制质膜(plasma membrane,PM)的MVE停靠位点的数量。Cortactin、coronin1b和Rab27a协调控制MVE对接位点和外泌体分泌的肌动蛋白稳定性[43]。有研究指出，HeLa细胞中有5种促进外泌体分泌的Rab GTP酶。其中，Rab27a或Rab27b敲低减少了MVE与质膜的对接。电子显微镜分析显示，来自Rab27a敲低细胞的MVEs显著大于来自对照细胞，而在Rab27b敲低细胞中MVEs则较小。另外，沉默两种已知的Rab27效应物，Slp4和Slac2b分别抑制外泌体分泌和表型沉默Rab27a和Rab27b，电子显微镜显示由Rab27a和Rab27b敲低细胞分泌的外泌体在大小和形态上与对照细胞产生的外泌体相同。表明沉默Rab27a或Rab27b主要是减少细胞培养上清液中释放的外泌体的量，但不修饰外泌体蛋白质含量或形态学。在Rab27a敲低细胞中Slp4蛋白水平降低，结果显示Rab27a和Slp4在HeLa细胞的MVE和外泌体分泌途径中共同起作用。相反，尽管Slac2b的沉默诱导了Rab27b敲低细胞的表型，但还没有研究证明这两种蛋白之间的功能相互作用[44]。

Rab27a与外泌体的形成和分泌密切相关，目前Rab27a在外泌体方面的研究主要是通过修饰Rab27a基因来调节外泌体分泌和作用效能，进而干扰疾病的发生发展。

3.2 Rab27a基因与肿瘤来源的外泌体

Rab27a特异性shRNA减少Rab27a表达水平，可以显著降低非小细胞肺癌细胞系(A549细胞)分泌外泌体[45]，乳腺癌细胞中的Rab27a阻断也减少了以内吞标记物为特征的外泌体的分泌。阻断Rab27a可导致原发性肿瘤生长减少和肺转移性癌(4T1)的播散，但不是非转移癌(TS/A)[46]。直肠癌(colorectal cancer,CRC)细胞中通过敲低Rab27a可抑制外泌体分泌从而抑制外泌体诱导的内皮细胞增殖和迁移[47]。通过敲除外泌体分泌调节剂Rab27a减少纤维肉瘤细胞向外泌体缺乏的血清的梯度迁移[48]。在B16F10黑色素瘤细胞系中，Rab27a shRNA也可以减少外泌体及一些血管生成生长因子(血小板衍生生长因子，胎盘生长因子)的分泌[46]。将Rab27a过表达载体转染到人A549细胞中，体外免疫来源于Rab27a过表达细胞的外泌体在小鼠模型中抑制肿瘤生长[49]。这证明了来自Rab27a过表达癌细胞的外泌体可引起更有效的抗肿瘤免疫效应，可为有效的基于外泌体的癌症疫苗的开发提供新的见解。外泌体向来被认为是肿瘤抗原的理想来源，并且在肿瘤免疫治疗中具有潜在的治疗作用。总的来说，体内肿瘤局部分泌外泌体可以促进肿瘤进展，而Rab27a又可以调节外泌体的分泌，因此，通过干预Rab27a从而干扰肿瘤的进展，具有临床意义。

3.3 Rab27a基因与其他来源的外泌体

研究表明，Rab27依赖产生的外泌体能抑制慢性炎症，并对炎性刺激产生急性应答。实验证明缺乏外泌体分泌的Ashen小鼠具有以升高的炎性细胞因子和骨髓增生为特征的慢性，低度炎症表型[50]。在帕金森病MN9D多巴胺能细胞模型的研究中发现，α-突触核蛋白(alpha-synuclein,αSyn)表达细胞经Mn处理后，Rab27a蛋白增加，其调节外泌体从细胞中的释放。新一代测序显示，与对照组外泌体相比，从暴露于Mn的细胞分离的外泌体中存在更多的miRNA。这表明Mn可能通过增加Rab27a蛋白调节外泌体miRNA表达水平，从而导致进行性神经变性[51]。急性骨髓性白血病则通过外泌体分泌将骨髓龛转化为白血病允许性微环境，通过靶向参与外泌体释放的重要调节剂Rab27a破坏急性骨髓性白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞中的外泌体分泌，可显著延迟白血病的发展[52]。外泌体还可以将miR-214转移到成骨细胞中以抑制其功能，Rab27a小干扰RNA抑制外泌体分泌阻止体内卵巢切除诱导的成骨细胞功能障碍[53]。在Ashen小鼠中，移植的骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSC)在梗死心脏中的存活增加，这表明，受损的心肌细胞衍生的外泌体加速了梗死心脏中移植的BMSC损伤，从而突出了心肌梗死后移植细胞损伤的新机制[54]。

4 总结

Rab27a是Rab家族的一类Ras小GTP酶，参与调控真核细胞内膜运输。一方面，Rab27a参与黑素体运输、调节NK细胞及T淋巴细胞等细胞中溶酶体相关细胞器(lysosome-related organelle,LRO)的转运和分泌颗粒的释放，其缺失引起GS2和CHM等疾病。另一方面，Rab27a对血管形成及多种肿瘤的迁移和侵袭等能力具有多样化调控作用，参与肿瘤的发生发展。其缺失通过抑制ROS形成及嗜中性粒细胞的浸润和功能等方面调节炎症反应，参与脓毒症等相关疾病发病。Rab27a缺失还能导致血小板聚集功能降低，血小板致密颗粒分泌数量减少，调控血栓形成等病理过程。此外，外泌体携带了许多蛋白质、脂质、mRNA和微小RNA，可参与细胞间通讯，是目前基因和药物传递的新型载体。Rab27a参与调控外泌体的释放，抑制Rab27a表达水平，不影响外泌体蛋白质含量或形态学，却能减少外泌体分泌水平。在非小细胞肺癌、乳腺癌、直肠癌等癌症中，Rab27a敲除能降低癌症细胞外泌体分泌，抑制其对周围受体细胞功能的影响，并且Rab27a过表达细胞产生的外泌体可抑制肿瘤生长，提示通过干预Rab27a治疗肿瘤的巨大潜力。除肿瘤细胞外，Rab27a还能调控多种细胞外泌体分泌参与疾病发病或发挥治疗作用，如神经变形疾病、白血病和心肌梗死等。众所周知，血小板活化可释放外泌体和微粒，而且血小板中高浓度表达Rab27a，Ashen小鼠可出现血小板聚集功能降低、出血时间延长和血小板致密颗粒分泌减少等情况。我们的初步研究表明，与C57小鼠相比，Ashen小鼠的血小板微粒在功能上有一定程度的缺失。鉴于血小板来源的微粒及外泌体在血栓形成机制上密切相关，推测Rab27a也可能通过调节血小板外泌体参与血栓形成的发生发展，当然，这还有待进一步探究。