离子色谱法快速测定动物源食品中5种生物胺

赵 好，查河霞，赵士权

（南京市疾病预防与控制中心，南京210003）

生物胺是一类具有生物活性和低的相对分子质量的含氮有机化合物的总称［1］，主要由氨基酸脱羧或醛和酮氨基化形成的。生物胺广泛存在于各类食品中，是生物体内正常的生理组分，起着重要的生理调节功能，但是过量的生物胺会对人体产生一定的毒害作用。如果人体摄入了过量的生物胺，尤其是同时摄入多种生物胺而产生了协同作用时，人体会产生头痛、腹部痉挛、呕吐、腹泻、心悸、血压变化、呼吸紊乱等类似过敏的反应，严重还会危及生命［2］。组胺是几种常见生物胺中对人体危害最大的生物胺［3］，当人体摄入8～40mg·kg－1组胺时就会产生轻微的中毒反应，摄入量为40～100mg·kg－1时会引起中度中毒，摄入量高于100mg·kg－1时会引起严重的中毒症状。若腐胺和尸胺与组胺同时存在则会抑制组胺的代谢，组胺的毒性在一定程度上被增强了［4］。生物胺对人体的毒害作用大小与人体的摄入量、各种生物胺之间的相互作用以及人体自身的肠道生理功能有关，少数敏感人群对生物胺的耐受剂量要远低于正常人［2］，因此很难确定生物胺的中毒剂量。目前，食品中生物胺的限量尚无统一的国际标准，各国根据本国的法律、法规以及具体国情分别制定标准，并且都只是对鱼类及其制品中组胺的含量进行了限定。美国食品药品监督管理局（FDA）认定组胺中毒的危害水平为500mg·kg－1。目前，我国对于生物胺的毒性阈值尚无定论，中国科学院与中国水产品科学研究院合作编写的包括《鲭鱼组胺中毒风险评估》在内的多种农产品安全风险评估为食品中组胺的风险评估提供了重要的依据［5］。

目前，国内外研究人员对水产品、肉类、水果、饮料等食品中的生物胺含量展开了研究，主要采用的测定方法有生物酶传感器法、色谱法、电泳法［6－7］等，其中以高效液相色谱法的应用最为广泛。我国食品卫生标准 GB／T 5009．208－2008中规定的食品中生物胺的测定方法就是高效液相色谱法（紫外检测器），此方法样品前处理必须进行衍生化，操作繁琐。本工作采用离子色谱法快速测定动物源食品中腐胺、尸胺、组胺、亚精胺以及精胺等5种生物胺，试验无需衍生化，样品前处理简单、高效，大大缩短了测定时间。

1 试验部分

1．1 仪器与试剂

IC 2000型离子色谱仪；DS 6型电导检测器；Dionex CERS 500型抑制器；XS－204型电子天平；H－1850R型高速冷冻离心机；C18固相萃取小柱。

5种生物胺标准储备溶液：1．00g·L－1，分别称取腐胺二盐酸盐、尸胺二盐酸盐、组胺二盐酸盐、亚精胺三盐酸盐、精胺四盐酸盐标准品［组胺二盐酸盐标准品的纯度为99．8%，其余标准品的纯度均为99．0%］各25．0mg，用水溶解后分别置于25mL容量瓶中，稀释至刻度，于4℃保存。根据需要将5种生物胺标准储备溶液配制成混合标准溶液系列。

甲基磺酸的纯度为99．5%，试验用水为超纯水（电导率为0．055μS·cm－1）。

1．2 仪器工作条件

Ionpac CS17分析柱（4mm×200mm），GS17保护柱（4mm×50mm）；抑制电流140mA；电导检测池温度为40℃；流量1．00mL·min－1；进样量25μL，以峰面积定量。淋洗液为甲基磺酸溶液，梯度洗脱程序：0～12．0min时，甲基磺酸溶液的浓度为10mmol·L－1；12．1～26．0min时，甲基磺酸溶液的浓度为35mmol·L－1；26．1～30．0min时，甲基磺酸溶液的浓度为10mmol·L－1。

1．3 试验方法

取食品样品，用食品加工机搅匀后分装备用。

取试样1．00g至25mL离心管中，加入0．25mol·L－1甲基磺酸（MSA）溶液10mL涡旋1min，在4 ℃下，以12 000r·min－1转速离心10min，取上清液1mL至10mL容量瓶中，用水稀释至刻度后，经C18固相萃取小柱，按仪器工作条件对采集液进行测定。

2 结果与讨论

2．1 色谱行为

5种生物胺混合标准溶液的色谱图见图1。

图1 5种生物胺混合标准溶液的色谱图Fig．1 Chromatogram of mixed standard solution of 5biogenic amines

由图1可知：5种生物胺在30min内可完全出峰，腐胺与尸胺的分离度稍差，但不影响其定量分析。

2．2 洗脱方式的选择

试验测定的5种生物胺与色谱柱固定相的亲和能力差异较大，如果采用等度洗脱方式，淋洗液浓度较低时，亚精胺和精胺这两种亲和力强的组分不出峰或者出现保留时间较长的情况，无法达到快速检测的目的；淋洗液浓度较高时，腐胺与尸胺两种组分无法分离。试验采用梯度洗脱的方式，各组分在短时间内都被洗脱出来，且有较高的分离度。

试验参考了文献［8］的方法并结合实际情况对淋洗液的梯度条件进行优化，优化的梯度条件见1．2节。

2．3 干扰试验

水产品及发酵肉类等样品中一些小分子的阳离子（如 Na＋、Mg2＋、Ca2＋）可能对测定产生干扰，依照试验方法，此类金属离子出峰时间最迟的是Ca2＋，干 扰 试 验 证 明，1 000mg·L－1Ca2＋对0．25mg·L－1腐胺标准溶液并没有干扰。

2．4 标准曲线和检出限

按仪器工作条件对5种生物胺的混合标准溶液系列进行测定，以5种生物胺的质量浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：5种生物胺的质量浓度均在0．25～25．0mg·L－1内呈线性，其线性回归方程和相关系数见表1。

以3倍信噪比计算方法的检出限（3S／N），其结果见表1。

表1 线性回归方程、相关系数及检出限Tab．1 Linear regression equations，correlation coefficients and detection limits

2．5 方法的精密度和回收试验

分别对鱼类（金枪鱼、鲅鱼）、香肠（蒜肠、广式香肠）、小龙虾这3类5种食品进行测定，并加入不同量的混合标准溶液进行回收试验，精密度和回收试验结果见表2，表2中“－”为未检出。

表2 精密度和回收试验结果（n＝6）Tab．2 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

表2（续）

由表2可知：腐胺的回收率为87．4%～130%，相对标准偏差（RSD）为0．70%～4．8%；尸胺的回收率为91．7%～124%，RSD 为0．90%～4．4%；组胺的回收率为 83．9%～101%，RSD 为 0．70% ～5．2%；亚精胺的回收率为83．4%～114%，RSD为0．40%～9．3%；腐胺的回收率为81．9%～110%，RSD为0．50%～4．8%。

2．6 样品分析

将小龙虾样品在常温下放置2d后按试验方法取样，提取后按仪器工作条件进行测定，小龙虾样品的色谱图见图2。

图2 小龙虾样品的色谱图Fig．2 Chromatogram of the sample of Procambarus clarkii

由试验结果可知：小龙虾样品已有轻度腐败的现象，尤其是腐胺与尸胺这两种生物胺的含量较表2中的本底值明显增大。

本工作采用离子色谱法快速测定动物源食品中5种生物胺，方法操作简单，切实可行，精密度与回收率均满足检测要求。检测周期较短，尤其适合突发中毒事件中对动物源食品中5种常见的生物胺含量的快速测定。

［1］ 何庆华，吴永宁，印遇龙．食品中生物胺研究进展［J］．中国食品卫生杂志，2007，19（5）：451－454．

［2］ 刘红，李传勇，曾志杰，等．水产品中生物胺的检测与控制技术研究进展［J］．食品安全质量检测学报，2015，6（11）：4516－4523．

［3］ BODMER S，IMARK C，KNEUBUHL M．Biogenic animes in foods：histamine and food processing［J］．Inflammation Research，1999，48（6）：296－300．

［4］ BARDOCZA S．Polyamines in food and their consequences for food quality and human health［J］．Trends Food Sci Tech，1995，6：341－346．

［5］ 钱永忠，李耘．农产品质量安全风险评估：原理、方法和应用［M］．北京：中国标准出版社，2005．

［6］ LANGE J，WITTMANN C．Enzyme sensor array for the determination of biogenic amines in food samples［J］．Anal Bioanal Chem，2002，372：276－283．

［7］ SUN X H，YANG X R，WANG E K．Determination of biogenic amines by capillary detrophoresis with pulsed amperometric detection［J］．J Chromatoger A，2003，1005（1／2）：189－195．

［8］ 孙永，刘楠，李智慧，等．抑制型电导检测－离子色谱法快速测定水产品中的生物胺［J］．食品安全质量检测学报，2015，6（10）：3992－3997．