血小板活化信号转导机制研究进展

卞敬琦，冯月男，牛雯颖，肖洪彬

血管出现损伤时，血小板会直接与损伤部位的激活因子相接触并受到刺激，引发血小板活化并最终导致血栓形成。病理性血小板异常活化会诱导闭塞性血栓的形成，这将增加人们患心脏病及卒中等缺血性疾病的风险。细胞内的信号转导黏附蛋白及可溶性激动剂是血小板活化的主要因素，它们与血小板膜受体相互作用进而引发血小板的一系列生理变化。随着对机体凝血机制研究的不断深入，越来越多的血小板活化信号通路被证实，近年来又发现了更为复杂的信号转导及放大网络。本文将对这些新发现的血小板活化信号转导机制进行概述。

1 血小板活化受体信号通路

1.1 黏附受体介导的血小板活化通路 在高血流量剪切力的作用下，血小板膜表面糖蛋白GPⅠb-Ⅸ-Ⅸ-Ⅴ复合物与血管内皮细胞表面或皮下组织中的血管假性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）结合。该复合物中的配体结合亚基GPⅠbα能够特异性识别VWF上的A1结构域并发生偶联，该偶联使血小板能够以滚动的方式黏附于受损伤部位。GPⅠb-Ⅸ介导的血小板与VWF的接触只是暂时的，需要更为稳定且持久的偶联结构。最新的研究证实，GPⅠbα上一个被称作机械敏感通路的区域在VWF依赖的拉力作用下会发生延展［1］。而GPⅠbα上的另一个亮氨酸重复结构同样会在VWF的介导下发生构象变化［2］，这些构象变化不仅能够增强血小板与VWF之间的稳定性，还可以使细胞内钙离子含量提升，促进血栓形成［3］。GPⅠb-Ⅸ与凝血酶的结合对于低剂量下凝血酶诱导的血小板活化具有重要影响。该机制普遍适用于凝血物含量较低的凝血过程，而该过程对体内血栓的形成同样至关重要［4］。

免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM）是免疫细胞活化相关受体胞浆区所共有的、以酪氨酸残基为基础的氨基酸序列，其中酪氨酸是蛋白激酶的磷酸化位点，磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，对白细胞的激活起着重要作用［5］。整合素以及GPⅠb-Ⅸ虽然与ITAM受体有关，但它们的信号转导却不以ITAM的信号通路为主，ITAM的作用主要体现在受体信号放大上［6］。位于人血小板上的ITAM受体亚基，如Fc受体γ链（FcRγ）与其对应的位于免疫球蛋白IgG上的FcγRⅡa受体的结合会导致人血小板对抗原抗体复合物以及聚集免疫球蛋白的应答。ITAM受体除了对血小板与白细胞信号传输有影响外，其对血小板的活化作用也是近年来研究的热点。ITAM与胶原受体（GPVI）信号传导有关，而胶原受体是血小板活化、黏附过程的重要元件。研究表明，GPVI与FcRγ形成的非共价复合物与一些特殊的家族激酶，如Lyn有关联，然而GPVI与Lyn的关系至今仍存在争议。一些研究者认为Lyn在GPIV介导的ITAM信号转导方面具有拮抗作用，其抑制了配对免疫蛋白受体B在ITAM信号转导通路中的促进作用［7］。此外，活性氧对于ITAM的信号放大作用同样具有重要影响［8］。

1.2 模式识别受体介导的血小板活化通路 病原相关模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）和损伤相关模式分子（damageassociated molecular patterns，DAMPs）是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类成份。PAMPs与DAMPs可通过 Toll样受体（Toll-like receptors，TLRs）、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体、糖基化终末产物受体（RAGE）等模式受体实现先天免疫及非感染性炎症应答的初始信号转导。最新的研究表明，TLRs和NOD均与促进血小板活化有关［9］。血小板表面分布有几种 TLRs，如 TLR1、TLR2、TLR4、TLR6 以及TLR9。研究表明，TLR2可在TLR1-/TLRs-特异性受体激动剂以及脂质衍生物的诱导下活化血小板［10］。TLR9则在氧化应激的过程中调节了血小板活化信号的传导。TLR4是血小板主要的脂多糖受体，其可促进血小板颗粒的释放与活化，且TLR4介导了髓样分化因子依赖的环磷酸鸟苷-蛋白激酶G血小板活化通路［11］。由模式识别受体引发的血小板活化很可能是机体针对微生物感染及组织损伤的炎性反应，已经有研究证明血小板活化与血栓形成对机体感染期间出现的败血症及动脉粥样硬化具有重要影响［12］。

1.3 可溶性血小板受体激动剂介导的G蛋白偶联血小板活化 血管损伤处释放的可溶性受体激动剂与血小板膜表面特异性受体的结合是血小板活化的关键。这些特异性受体绝大多数是G蛋白偶联受体（G-protein-coupled receptors，GPCR）。GPCR 家族是一组拥有7个跨膜域结构的膜蛋白，该受体的细胞内信号转导主要依靠其配体系统。与配体结合的GPCR会发生构象变化，从而表现出鸟苷酸交换因子的特性，三磷酸鸟苷（GTP）与G蛋白上固有的二磷酸鸟苷（GDP）的交换使得α亚基与β、γ亚基分离，G蛋白随即变为激活状态，并参与下一步的信号传递过程，而具体的传递通路则取决于α亚基的种类。典型的G蛋白亚基Gαi及Gαs，其偶联受体分别为P2Y12与前列腺素受体PTGIR。Gαi及Gαs均可与腺苷酸环化酶结合，Gαs会通过刺激腺苷酸环化酶而促进腺苷酸的合成，Gαi则会抑制该反应。最新研究表明，腺苷酸可利用其依赖的腺苷酸蛋白激酶使血小板保持稳定状态，而Gαi可通过拮抗抑制血小板合成的第二信使（环腺苷酸）达到激活血小板的目的［13］。

1.4 血小板激活途径不同受体之间的协同作用 一些血小板激活剂存在多个血小板受体，最佳的血小板活化途径常常需要多个受体通路的协同作用。二磷酸腺苷（ADP）是一种由血小板颗粒及受损细胞释放出的血小板激活剂，其需在Gαq偶联的P2Y1及Gαi偶联的P2Y12共同信号作用下活化血小板。血凝素诱发的血小板活化网络较为复杂，在血小板表面至少有3种血凝素受体：人源的血小板膜糖蛋白（PAR）1、PAR4和GPⅠb-Ⅸ以及鼠源的血小板膜糖蛋白PAR3、PAR4和GPⅠb-Ⅸ。研究证实，在血凝素的刺激作用下，PAR1会通过与PAR4形成异源二聚体的形式增强PAR4的裂解［14］。研究表明，PAR4与P2Y12形成的异源二聚体促进了信号的传递，进而导致与血小板激活相关蛋白激酶的活化［15］，针对于P2Y12的治疗则可有效预防血小板的异常活化［16］。在血小板活化机制中，GPⅠb-Ⅸ会促进血凝素的分解，或者作为一个独立的血小板活化信号，因此GPⅠb-Ⅸ的作用一直存在争议。最近的研究结果表明，GPⅠb-Ⅸ既不是一个被动的血凝素识别位点，也不是PAR-依赖的血凝素受体，但血凝素诱导的GPⅠb-Ⅸ信号转导与PAR信号的协同作用是血小板应答的最佳方式［4］。这些不同受体的协同作用极大地增强了血小板对血凝素浓度的敏感性，该机制对动脉血栓的形成极为重要［4］。

2 信号放大网络

2.1 磷脂酶C、钙调节及甘油二脂（DAG） 磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）是大多数血小板活化信号通路的整合中心。血小板表达了至少3种不同的PLC––PLCβ、PLCγ以及PLCδ。在人的血小板中，PLCγ2 的含量高于 PLCβ2 并均高于 PLCβ3，且PLCβ与PLCγ拥有不同的激活机制，PLCβ受Gαq的影响，而PLCγ则受酪氨酸激酶介导的酪氨酸磷酸化的调控。然而最新的研究成果表明，Gαq偶联的受体激动剂也会通过活性氧介导的信号通路诱导PLCγ的磷酸化［17］。PLC的主要功能之一是催化45-磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）分解为DAG和1,4,5-三磷酸肌醇（IP3）。IP3与IP3受体的结合使得Ca2+从复杂的管状系统释放到胞质内，该过程是凝血过程中Ca2+升高的主要机制。细胞内Ca2+浓度的升高在血小板活化过程中扮演了重要角色，其同时也是大部分细胞进行信号传导的重要方式之一。DAG可活化常规（α、β）及特殊（δ、θ、η、ε）的蛋白激酶 C（PKC）同系物，这些同系物在整合素激活及血小板颗粒释放过程中发挥了重要作用。研究表明Ca2+浓度的增加促进了Ca2+与DAG调控相关鸟嘌呤核苷酸传递因子Ⅰ（CalDAG-GEFⅠ）的释放［18］。尽管 CalDAGGEFⅠ上仅存在一个低亲和力的DAG结合位点，但并不排除其参与了CalDAG-GEFⅠ的活化过程［19］。

2.2 磷脂酰肌醇3-蛋白激酶（PI3K）通路 PI3K通路是诱导血小板颗粒释放、激活及黏附的重要信号放大网络。在众多磷酸肌醇成员中，3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（PIP3）主要由4,5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）在Ⅰ型PI3K的作用下转变而来。受体激动剂激活PI3K并产生PIP3，PIP3能够与3-磷酸肌醇依赖的蛋白激酶1（PDK1）及其蛋白激酶亚型PIP3受体位点结合，进而导致PDK1磷酸化及蛋白激酶活化。在血小板中，蛋白激酶B（Akt）共含有3种异形体，敲除任何一种都会导致血凝素含量降低以及凝血恶烷A2类似物诱导的血小板活化减弱［20］。一氧化氮合成酶（NOS）与糖原合成酶激酶3（GSK3β）是2种蛋白激酶效应因子，它们被证实可以调节PI3K激酶的信号转导，导致血小板颗粒的分泌及活化。研究表明，GSK3β在不同的血小板活化途径中扮演了不同的角色，首先其可以抑制血凝素诱导的血小板活化，但在胶原蛋白诱导的血小板活化过程中，GSK3β 似乎又能起到促进作用［20］。然而 GSK3β的活化机制目前尚不清楚。最新的研究表明，PI3K家族的第二类成员PI3KC2α对血栓在血流中形态的保持发挥了重要作用［21］。此外，PI3K家族的第三类成员PI3K vps34可通过影响氮氧化物的组装调节血小板活性且与血小板的自噬有密切关系［22］。

2.3 血小板环鸟苷酸（cGMP）信号通路新概念 cGMP在cGMP依赖的蛋白激酶（PKG）活化过程中扮演了重要角色。血小板激动剂能够刺激cGMP含量的升高，且外源性cGMP类似物的刺激也会对血小板产生影响。早期对于由NO诱导的可溶性环鸟苷酸的研究表明，NO-cGMP通路能够有效抑制血小板的活化，但几乎全部的拟cGMP药物并不能有效抑制血小板的生理功能。直到最近，这一概念受到了NO-cGMP-PKG双向信号传导研究的挑战。研究人员发现，血小板活化过程中高浓度的NO及cGMP会抑制血小板的活化，而细胞内部早期合成的低浓度NO及cGMP则可以促进血小板的活化过程，且能够显著增加血小板对激动剂的敏感度［23］，该血小板活化cGMP-PKG通路模式识别受体的重要作用已被多个研究小组成功证实［24］。

2.4 类花生酸通路 类花生酸作为第二信使为血小板活化传递信号，成员包括前列腺素类、凝血恶烷类和白细胞三烯类等。类花生酸的合成需要钙离子依赖的细胞溶质磷脂酶A2（PLA2）的活化，其可以水解磷脂膜释放花生四烯酸（AA）。研究表明，AA是通过环氧合酶（COX）和脂氧合酶途径进行代谢的［25］。COX 可以将 AA 转化为前列腺素（PG）［26］。血小板合成的几种PG中凝血酶A2（TXA2）是一种有效的血小板激动剂，其在增强血小板活性方面起着重要作用，TXA2与血小板偶联受体Gq-/G13-的结合可以促进血栓的形成。

2.5 颗粒物分泌介导的信号放大 血小板活化过程中最常见的信号放大机制是血小板颗粒的分泌。血小板含有3种主要分泌细胞器：含有小分子的δ颗粒、含有黏附蛋白的α颗粒以及含有降解酶的溶酶体［27-28］。已分泌的血小板颗粒不仅能够增强血小板活化信号，还可以激活处于休眠状态的血小板，该机制极大地促进了血栓的形成。此外，分泌出的颗粒物有助于血管损伤及炎症的修复，当然也不可避免地增加了病理性动脉粥样硬化及血液中癌细胞的扩散。血小板颗粒释放的关键机制是颗粒膜与血小板及开放微管系统中原生质膜的融合，该融合使得血小板颗粒释放到胞外环境中。随着血小板连续的收缩，大量的颗粒被源源不断地释放出来，该过程受到N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白（NSF）、可溶性NSF连接蛋白（SNAP）以及可溶性NSF连接蛋白受体（SNAREs）的调控［27-28］。细胞内 Ca2+浓度的升高及SNARE的磷酸化在某种程度上也刺激了颗粒物的分泌。几乎所有的血小板激动剂都会刺激血小板颗粒的分泌，如胶原蛋白和血凝素等“强”激动剂会直接诱导血小板颗粒的分泌及聚集。相比之下，一些“弱”激动剂，如ADP或者低浓度的“强”激动剂需要在整合素等外源信号的介导下才能激活颗粒的分泌。目前已证实的与促进血小板颗粒分泌相关的因子及信号通路包括：（1）钙离子浓度。（2）PKC信号通路。（3）Src家族激酶信号通路。（4）PI3K/AKT 及NO/cGMP/PKG信号通路。（5）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路。（6）CalDAG-GEFI与 Rap1b信号通路。（7）RhoGTPase Rac1与RhoA信号通路。这些通路的作用机制尚不明确，仍需进一步研究证明。

3 展望

血小板活化信号在血小板诱导的血栓形成中发挥了重要作用，多年来一直是研究者关注的焦点。相比于传统的血小板活化概念，一些新出现的更为庞大且复杂的血小板信号激活及放大网络越来越受到人们的关注。这些新理论的出现不仅使研究者对血小板活化机制有了更深入的认识，同时也对传统理论发起了严峻的挑战。借助于动物模型技术的发展以及创新型药物的研究，更多的血小板活化信号转导机制将被阐明，血小板相关生理学领域的研究也将取得长足进步。

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