血清miR-126-5p检测在肺癌诊治中的临床价值*

陈艳敏 黄江浩 刘平 於艳霞 韦淑娴 叶佐婉

(广州医科大学附属深圳沙井医院，广东 深圳 518104)

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一[1],目前肺癌病死率约是40年前的10倍,已成为病死率最高的肿瘤疾病[2]，肺癌每年约160万新增病例、130万死亡病例[3]。肺癌的早期诊断是提高患者治愈率和降低病死率的关键，大量研究发现miRNA在动物、植物及病毒中广泛存在，并且参加了细胞分化、增殖、凋亡、代谢、肿瘤发生及转移等多项生命活动[4，5],随着人们对微小RNA研究的深入，已有大量文献报道miRNA基因作为肿瘤标志物可作肺癌诊断,肿瘤标志物对肺癌的早期诊断以及疗效判断与监测有一定的临床意义]。血清中miR-126-5p是体内重要的微小RNA基因，研究发现，miR-126对于心血管系统特异性最高，对于胚胎组织、呼吸系统、造血系统等也有较高特异性[6]，Shen等[7]鉴定出了在早期非小细胞肺癌中异常表达的12种miRNAs，其中miR-21、 miR-126、miR-210、miR-486-5p用于区分NSCLC患者与健康者的的敏感性及特异性分别为86%、97%，其肺癌患者血清中高表达及较高的灵敏度和特异度的特点对肺癌诊断有较大临床价值,可作为肺癌早期诊断的肿瘤标志物。

1 资料与方法

1.1 本文资料为55例肺癌患者组和包括21例健康对照者及32例肺部良性疾病患者的非肺癌组。本项目完成的前提是收集到大规模的合格标本，在病人知情同意下，我们在本院和广州医科大学呼吸疾病研究所收集标本，挑选未经治疗且处于疾病I/II期的新发病例，经病理学确诊的肺癌患者为肺癌组，病人入选标准包括疾病局限于胸部，没有远端转移的证据，排除高血压、心血管疾病及糖尿病疾患。 ①肺癌组患者55例，男性31例，女性24例，平均年龄60.71岁，中位数60岁。②非肺癌组患者53例，男性24例，女性29例，平均年龄57岁，中位数53岁。非肺癌组中包括健康对照者(A亚组)21例和(B亚组)中的32例肺部其他疾病患者(肺部感染、结核性胸膜炎、肺结核、慢性阻塞性肺疾病、矽肺等)。标本采集前一年内没有外科手术史和放射治疗史，病例至少跟踪随访两年。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有受检对象均于早晨6：00～9：00空腹用EDTA抗凝管静脉采血5 ml并混匀抗凝，30min内于4 ℃，3000 r/min离心10 min分离血清，上层血浆分装至 1.0 ml冷冻管,每管0.5 ml,置-80 ℃贮存备用。

1.2.2 miRNA提取用miReasy Mini Kit试剂(Qiagen德国)提取血浆中的miRNA。主要步骤如下：①向400 ul血浆中加入5倍体积的QIAzol试剂，室温放置5 min。②加入等体积100 %氯仿，放置2～3 min。③4 ℃、12000 r/min离心15 min后将离心机调至室温。④ 取上层水相300 ul，加入1.5倍体积100 %乙醇，充分混匀。⑤将混合液依次转移至RNeasy Mini spin column柱子中，12000 r/min室温下离心15 s，弃废液。⑥加700 ul Buffer RWT，离心 (同上)，弃废液。⑦加500 ul RPE，离心 (同上)，弃废液。⑧重复步骤7。⑨换新2ml 收集管，空转2min。⑩用30ul的RNease-free water溶解RNA。置于-70℃低温冰箱备用。为将RNA提取效率及PCR数据标准化,在每个提取标本中加入25飞摩尔的合成线虫miR-54(Cel-miR-54)。

1.2.3 RT-qPCR检测 应用miScript Reverse Transcription Kit 试剂(Qiagen德国，part No：4440044)于普通PCR仪(上海宏石 SLAN-96P)上进行miRNA的逆转录。由于血清中miRNA的浓度较低，按照试剂盒说明书，取15 ul模板RNA+4 ul Buffer RT+1 ul Mix，反应体系为20 ul，反应条件为：37 ℃、1 h，95 ℃、5 min。qPCR(美国ABI step one plus)反应采用miScript SYBR Green PCR Kit 试剂盒(Qiagen，德国,lot No：1507052)，按照试剂盒说明书依次加入反应所需的cDNA模板和试剂:①1ul cDNA+0.4ulmiRNA特异性引物+10ul Mix+2ul UP+6.6ul H2O；②1ul cDNA+0.4ul U6F/R+10ul Mix+8.2ul H2O。反应体系均为20ul。反应条件为：95℃、15min，94℃、30s，55℃、15s，70℃、30s，设置2个重复孔，40个循环结束。反应在qPCR仪上进行(ABI step one plus)。

1.2.4 分析定量PCR数 应用RT-qPCR技术检测肺癌血浆中miR-126-5p的表达水平。miR-126-5p为目的基因，miR-Cel-54作为内参基因作数据的标准化处理。目的基因的相对表达量(Re)应用2-△CT公式进行计算，△CTc=CTc目-CTc内，△CTn=CTn目-CTn内。对目的基因的相对表达量进行对数处理后(log2Re=-△CT)。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件进行统计学分析miR-126-5p在组间的分布差异。P<0.05 为有统计学差异。采用ROC曲线分析指标的诊断灵敏度和特异性，通过检测结果作图绘成ROC曲线。

2 结果

2.1 肺癌组与非肺癌组血清miR-126-5p检测结果比较 肺癌组样本检验的均值(△CT)为-1.30，标准差为2.18；非肺癌组样本检验的均值(△CT)为1.17，标准差为4.08。两组间的-△△CT为2.48。miR-126-5p在肺癌组的含量是非肺癌组的倍数FC为5.57，FC>1，见表1。

表1 肺癌组与非肺癌组血清miR-126-5p检测结果比较Table 1 The serum miR-126-5p

注：-ΔΔCT=ΔCTGROUPN-ΔCTGROUPC

2.2 miR-3405p肿瘤标志物在各组血清中的表达及相关统计学指标 方差方程的Levene检验及均值方程的t检验均显示，miR-126-5p在肺癌组与非肺癌组之间的差异有统计学意义〔(F=14.81P<0.001)，(t=-3.91P<0.001)〕；方差方程的Levene检验和均值方程的t检验均显示，miR-126-5p在非肺癌组中的健康人(A亚组)和肺部良性疾病(B亚组)之间的差异均无统计学意义〔(F=1.12P>0.05),(t=-1.314P>0.05)〕，见表2。

表2miR-126-5p肿瘤标志物在各组血清中的表达及相关统计学指标

Table2miR-126-5pserumtumormarkersandtherelatedstatisticalindicators

组别相关统计学指标FPtdfP(双侧)肺癌组与非肺癌组14810⁃3917890A亚组与B亚组 1120097⁃131476080106

2.3 miR-126-5p的相对表达量、灵敏度、特异度在肺癌中的诊断价值 用ROC曲线来评价miR-126-5p的相对表达量在肺癌的诊断价值，相对表达量曲线下面积AUC为0.666，渐近 95% 置信区间为0.563～0.768，渐进Sig.b为0，差异具有统计学意义(P<0.001)，表明诊断价值较高(见表3图1)；miR-126-5p对肺癌诊断的灵敏度为66.1 %，特异度为71.7 %，诊断临界值为12.25。

表3miR-126-5p的相对表达量、灵敏度、特异度在肺癌的诊断价值评价

Table3Thesensitivity,relativeexpressionofspecificevaluationofmiR-126-5pinthediagnosticvalueoflungcancer

指标ROC曲线下面积渐近95%区间灵敏度(x10⁃2)特异度(x10⁃2)miR⁃126⁃5p06660563～0768661717

图1 miR-126-5pROC曲线图Figure 1 miR-126-5 proc plot

2.4 肺癌组与非肺癌组的检测结果在年龄、性别上均无统计学意义(P>0.05)(P=0.103、P=0.338)。

3 讨论

RNA是长度约为19～25bp的非编码基因的大家族，miRNAs在循环血液中可稳定存在，能够耐受高温、强酸、强碱等多种极端条件[8,9]，在基因表达中起着调控作用，其表达量随肿瘤疾病的发生发展而变化，已有研究报道与多种肿瘤疾病相关，如肺癌[10]、胃癌[11]等。miRNA广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡、应急反应、免疫反应等多种生命活动过程，作为癌基因或抑癌基因对肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、转移以及血管生成的调节发挥着重要作用，Wang XC等[12]研究发现，miR-126通过P13k的-AKT途径对扩散的非小细胞肺癌癌细胞进行调控，引起凋亡。肿瘤相关miR在肿瘤疾病发生发展过程中稳定存在于血液中，有研究发现miRNAs可以调节原癌基因和抑癌基因的表达[13]，在肿瘤研究领域，miRNA已被用于癌症的分段[14], 有研究表明[15，16，17]，miR-126通过对其靶基因的调节调控细胞增殖、分化和凋亡，参与了肿瘤的发生、侵龚和转移，在细胞的生长发育、癌变等生命过程中，通过作用多种靶基因而在肿瘤发生发展过程起着非常重要的作用 ，其在肺癌的发生发展中的重要作用，可能成为肺癌治疗的可选靶点之一。还有研究表明，肺癌等疾病中有miRNA表达变化[18]，miR-126浓度对非小细胞肺癌诊断有一定的诊断临床意义[19]，因而可用于肿瘤疾病的诊断。目前通过miRNA芯片杂交方法许多恶性肿瘤的miRNA表达谱得以建立，其中一些miRNA成为肿瘤治疗的新的靶点并成为临床患者预后的肿瘤标志物。miRNA对肺癌疾病的诊断价值，已引起人们的广泛关注，目前已报道的miRNA对肺癌的诊断价值不一，为进一步研究提供了依据。

近几年,由于各种原因,多种肿瘤发病率明显增加,很多肿瘤患者直至疾病晚期才确诊,大多数肿瘤现在仍无有效的治疗方法,总体生存率较低[20，21 22]。有研究证实[23，24，]，肿瘤患者血清或血浆游离出的miRNA，成为很有价值的肿瘤检测指标，而且miRNA在血清呈稳定状态易于被检测。本研究结果显示，miR-126-5p在肺癌患者组的含量是非肺癌患者组的倍数FC为5.57, 表明其在肺癌患者组是高表达.肺癌患者血清中的miR-126-5p水平明显高于非肺癌患者，表明miR-126-5p可作为诊断肺癌较为理想的指标。miR-126 ROC曲线下面积AUC为0.666,灵敏度，特异性均较高(66.1 %和71.7 %)，表明其对肺癌有中度的诊断能力和较高的排出其他疾病的能力,有望成为新的肿瘤标志物.健康对照组与肺良性疾病组血清miR-126-5p水平无差异，表明其对肺部良性病变诊断无临床意义。肺癌组与非肺癌组的检测结果在年龄、性别上均无差别，表明本次实验肺癌与年龄、性别不存在相关性，与文献报道[19]相一致。此研究国内外尚无报道，于是我们进行了本课题的研究，经多方努力，确认本研究实验有较大的临床价值。

4 结论

应用RT-qPCR技术，对血液中miR-126-5p肿瘤标志物分析，本实验提示miR-126-5p对肺癌有一定诊断价值，在肺癌确诊尚无理想方案的情况下，miR-126-5p可作为一个参考指标，但miR-126-5p在肿瘤发病机制中的作用及其靶基因功能尚需深入研究,尽可能标化检测方案和参考范围，为肿瘤诊断提供新的突破口。

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