大黄素通过PPARγ/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应*

任凯旋 涂岳圣 朱涛 骆万婷 林家衍 叶焕荣 方俊杰

(1.南方医科大学临床医学五年制，广东 广州 510280；2.南方医科大学珠江医院呼吸内科，广东 广州 510280)

炎症是机体对损伤产生的一种保护性反应，但过度的炎症反应也可直接导致组织细胞的损伤和死亡，抗炎治疗目前已经成为慢性炎性疾病的主要治疗手段，如对动脉粥样硬化、类风湿关节炎、哮喘、脓毒血症、急性呼吸窘迫综合征和急性胰腺炎等[1-5]。大黄素是大黄的主要药理成分，研究发现大黄素对多种炎症性疾病如急性胰腺炎、动脉粥样硬化及哮喘有良好的治疗效果[6-7]。有实验证明大黄素对炎症的调控作用主要与阻断NF-κB的活化密切相关[7-8]。同时有研究显示PPARγ信号通路可能参与了大黄素对NF-κB活化的调控作用，但具体的关系尚未明确[8-9]。因此，本研究旨在探究大黄素对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎症反应的调控作用及其相关信号通路，现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和材料 RAW264.7细胞购自中国典型培养物保存中心；大黄素及LPS购自Sigma Chemical公司；siRNA-PPARγ (sc-29455) 和siRNA-scrambled (sc-37007)购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin、ICAM-1抗体、MCP-1抗体、PPARγ抗体、NF-κB p65及磷酸化NF-κB p65抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；超纯水。其余试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将RAW264.7细胞培养于添加青霉素(100 IU/mL)、链霉素(100 μg/mL)以及10%热灭活胎牛血清的培养基中，置于37°C、95%空气、5% CO2孵箱内培养，取对数生长期细胞用于实验。取细胞置于96孔板上，密度为每孔2×103个细胞。预先用大黄素(25 μM)干预RAW264.7细胞。使用siRNA转染RAW264.7细胞。干预4h后加入LPS (100 ng/mL)。6h后使用MTT比色法检测细胞活性[10]。提取蛋白和mRNA，同时收集培养液上清保存于-80°C用于ELISA。

1.2.2 细胞ICAM-1 mRNA、 MCP-1 mRNA表达检测 qPCR测定ICAM-1和 MCP-1的mRNA表达定量，β-actin为内参，按照PCR试剂盒说明书提取总RNA。采用PrimerScript RT试剂盒用于反转录。使用iQ 5多色实时荧光定量PCR检测系统和荧光定量PCR试剂盒用于扩增，得到含1.6ul cDNA的培养液20ul，加入正向及反向引物各0.8 μL、10μL SYBR Premix Ex TaqTM II及6.8 μL去离子水。引物和探针使用Primer Premier设计。引物序列为：ICAM-1正义：5’-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3’，反义：5’-CCTT CTAAGT GGTTGGAACA-3’；MCP-1正义：5’-TTAAAAA CCTGG ATCGGA ACCAA-3’，反义：5’-GCATTAGC TTCAG ATTTAC GGGT-3’；PPARγ正义：5’-AGGTGT GATATCCG GTAGAT-3’，反义：5’-TTATTC ATCAGG GAGGCCAG-3’；β-actin 正义：5’-GATTAC TGCTCT GGCTCC TAGC-3’，反义：5’-ACTCAT CGTA CTCC TGCTTGCT-3’。基因表达水平变化采用2△△Ct法测定，△△Ct=(Cttarget-Ctβ-actin) sample-(Cttarget-Ctβ-actin) control[11]。

1.2.3 Western blot 将分别含有等量蛋白(150 μg)的样本溶解于10% Tris-glycine SDS电缓冲液，转膜后使用ICAM-1抗体，MCP-1抗体，PPARγ抗体，磷酸化NF-κB p65抗体，NF-κB p65抗体或β-actin抗体作为一抗在4°C环境下孵化24h，加入二抗并室温下孵化1h。用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。使用ICAM-1/β-actin、MCP-1/β-actin和PPARγ/β-actin以及Phospho-NF-κB p65/total NF-κB p65显影强度比值进行蛋白表达量及磷酸化水平分析[12]。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0进行单因素方差分析，计量资料以均数±标准差表示。两样本均数多重比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞ICAM-1、MCP-1和TNF-α的表达水平 与Control组相比较，RAW264.7细胞在LPS干预6h后ICAM-1、MCP-1 mRNA和蛋白的表达量及TNF-α的表达水平明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。但LPS组较Emodins+LPS组和Emodins+LPS+siRNA-PPARγ组ICAM-1、MCP-1 mRNA和蛋白TNF-α的表达水平升高更加显著，差异均有统计学意义(P<0.05)；且Emodins+LPS+siRNA-PPARγ组较Emodins+LPS组升高更加明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时Emodins+LPS组和Emodins+LPS+siRNA-scramble组ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表达水平及TNF-α的表达水平未见明显差异，差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1、表1。

图1 RAW264.7细胞MCP-1和ICAM-1 western blot结果

Figure1ThewesternblotresultsofMCP-1andICAM-1inRAW264.7cells

表1RAW264.7细胞ICAM-1和MCP-1mRNA和蛋白的表达水平与TNF-α表达水平(n=4, ±s)
Table1TheexpressionofICAM-1,MCP-1,TNF-αinRAW264.7cells

组别MCP⁃1mRNAMCP⁃1蛋白ICAM⁃1mRNAICAM⁃1蛋白TNF⁃α蛋白Control组1．00013±0041．00009±0051156±128Emodin组124±051017±004117±026010±00327885±2671LPS组2217±352①097±007①2038±287①095±005①12765±1614①LPS+Emodin组537±133①②③041±008①②③687±098①②③028±012①②③9054±896①②③LPS+Emodin+siRNA⁃PPARγ组1526±218①②081±015①②1624±216①②075±014①②18972±2445①②LPS+Emodin+siRNA⁃scrambled组561±109①②③039±006①②③644±084①②③026±009①②③8876±1009①②③

注：与Control组比较，①P<0.01；与LPS组比较，②P<0.01；与LPS+Emodi+siRNA-PPARγ组比较，③P<0.01。

2.2 细胞PPARγ mRNA和蛋白表达及NF-κB p65活化水平 与Control组相比较，RAW264.7细胞在LPS干预后PPARγ mRNA和蛋白的表达量明显降低，NF-κB p65磷酸化水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)。但LPS组较Emodins+LPS组和Emodins+LPS+siRNA-PPARγ组PPARγ mRNA和蛋白的表达下降更加明显，NF-κB p65磷酸化水平升高更加显著，差异均有统计学意义(P<0.05)；且Emodins+LPS+siRNA-PPARγ组较Emodins+LPS组PPARγ mRNA和蛋白表达的下降及NF-κB p65磷酸化水平的升高更加明显，差异均有统计学意义(P<0.05)。同时Emodins+LPS组和Emodins+LPS+siRNA-scramble组PPARγ mRNA和蛋白表达及NF-κB p65磷酸化水平未见明显差异，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2、图2。

表2 RAW264.7细胞PPARγ mRNA及其蛋白表达和NF-κB p65活化水平Table 2 The mRNA and protein expression of PPARγ, and the activation of NF-κB p65 in RAW264.7 cells

注：与Control组比较，①P<0.01；与LPS组比较，②P<0.01；与LPS+Emodi+siRNA-PPARγ组比较，③P<0.01。

图2RAW264.7细胞PPARγ蛋白表达和NF-κBp65磷酸化的westernblot结果

Figure2ThewesternblotresultsofPPARγandtheactivationofNF-κBp65inRAW264.7cells

3 讨论

目前研究认为适度的炎症反应对机体有保护作用，但严重的级联放大和失控的炎症反应会导致机体的系统性损伤。目前发现巨噬细胞(macrophage)在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome, ALI/ARDS)和支气管哮喘等炎症相关性疾病的发生发展过程中起着重要的作用[13-15]。细菌、病毒和真菌等感染导致的炎症因子(inflammatory mediators)大量释放间接和/或直接地刺激巨噬细胞、血液中的单核细胞以及其他初级免疫细胞活化，导致更多的炎症细胞的过度活化和炎症介质如TNF-α、MCP-1、ICAM-1、IL-1β及IL-6等的过度合成和分泌，从而造成肺泡上皮细胞和血管内皮细胞等的损伤[4, 8, 15-17]。有研究显示抑制巨噬细胞活性有利于减轻ARDS及其他炎症相关性疾病包括脓毒血症和动脉粥样硬化等的组织和系统性损伤[16-20]。Liu Y等的研究表明抑制巨噬细胞诱导性一氧化氮合酶(iNOS)的表达可减轻LPS诱导的ALI相关的炎症反应[21]；Yu W等人研究证实二苯乙烯苷(Tetrahydroxystilbene Glucoside, TSG)可以通过活化HO-1减轻LPS诱导的小鼠巨噬细胞的活化及炎症因子的释放[22]。霍本辉等的实验发现橙皮苷可以通过下调HMGB1表达抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症分子的合成和释放[23]。

大黄素(emodin)是大黄的有效成分，目前发现大黄素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗纤维化、抗炎、抗动脉粥样硬化、免疫抑制以及调节代谢等多种药理活性[8-9, 24]。Jia X等发现在高脂血症小鼠模型中大黄素对LPS诱导的肝细胞损伤及炎症反应有抑制作用[24]。Xiao M等在小鼠动物模型中发现大黄素可有效改善LPS诱导的肺组织炎症反应和损伤水平[8]。TNF-α作为最重要的促炎症分子(pro-inflammatory mediator)在包括ARDS和慢性阻塞性肺疾病(COPD)等在内的多种炎症相关疾病中发挥重要的生物学生物活性，研究表明肺组织中TNF-α可一方面可导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞的损伤，同时可以诱导更多的炎症分子的释放[3-5]。研究发现MCP-1和ICAM-1作为巨噬细胞分泌的重要炎症分子，在LPS诱导的炎症反应中亦有重要的价值和意义。进一步的研究发现抑制巨噬细胞TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎症介质的合成和释放对ARDS和哮喘等炎症相关性疾病有保护作用[13, 18-19]。在本研究我们发现大黄素可以有效抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞ICAM-1和MCP-1 mRNA和蛋白的表达量及TNF-α的表达水平，差异均有统计学意义(P均<0.05)。该结果提示大黄素对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应有明显的抑制作用。

进一步研究发现大黄素的多种生物活性与PPARγ/NF-κB信号通路的活化明确相关[11, 24, 26]。PPARγ/NF-κB信号通路的过度活化在ARDS、哮喘、COPD及脓毒血症等炎症疾病的发生和发展过程中扮演着重要的角色。同时大量研究证实PPARγ/NF-κB信号通路对于TNF-α、MCP-1和ICAM-1等炎症分子的表达具有关键的调控作用[9, 11, 26]。Yang Z等的研究发现大黄素可以通过抑制PPARγ/NF-κB通路的活化减轻LPS诱导的小鼠乳腺上皮细胞TNF-α、IL-6、iNOS和COX-2等炎症分子的合成[9]。在本实验中我们发现大黄素可以有效抑制LPS诱导的PPARγ表达水平下降及NF-κB p65磷酸化水平增高。同时在本研究中我们还发现大黄素对于PPARγ表达和NF-κB p65磷酸化水平的调控作用可被siRNA-PPARγ明显阻断。该结果表明大黄素对于LPS诱导状态下的PPARγ/NF-κB信号通路具有调控作用。

4 结论

本文资料显示，大黄素可以通过调控PPARγ/NF-κB信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，为大黄素应用于支气管哮喘、ARDS和类风湿性关节炎等炎症相关性疾病的临床治疗奠定了理论基础。

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