水蛭的化学成分研究*

李国强，李韵仪，李 桃，李药兰，王国才，王春华，李 正

（1.佛山科学技术学院，食品科学与工程学院，佛山 528000；2.暨南大学药学院，广州 510632；3.天津中医药大学中药制药工程学院，天津 300193）

中药水蛭为水蛭科动物蚂蟥（Whitmania pigra）的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥的功效，主治血瘀经闭、癥瘕痞块、中风偏瘫以及跌打损伤等症[1]。水蛭的炮制方法《伤寒论》中有所记载，大致有净制、切、加辅料和不加辅料制几大类，十几种炮制方法。现代对水蛭的炮制大多采用酒制、滑石粉烫、砂烫等方法。水蛭的主要成分为大分子类化合物，主含蛋白质，含有17种氨基酸，水解氨基酸含量高达49.4%，包括人体必须的8种氨基酸[2]；还含有如水蛭素、肝素、组织胺、吻蛭素、氨基酸等；水蛭中也含有糖脂类、蝶啶类、甾体类和羧酸酯类等多种小分子类物质；此外微量元素主要含有Zn、Mn、Fe、Co、Cr、Se、Mo、Ni等 14 种微量元素。水蛭具有抗细胞凋亡、抗肿瘤、抗凝、抗血栓、抗炎、抗纤维化等药理作用[3-7]。随着水蛭的人工培养和环境的变化，水蛭的化学成分研究一直是科研工作者的研究热点和难点。所以，为进一步充分利用和开发中药水蛭，丰富水蛭药材的化学成分组成，为水蛭的药效学研究提供科研数据，本实验对中药水蛭的化学成分进行了系统研究，从中分离并鉴定了9个化合物，分别为:吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷（1）、3-吲哚-甲醛（2）、腺苷（3）、2-羟基嘌呤核苷（4）、尿嘧啶核苷（5）、腺嘌呤（6）、尿嘧啶（7）、黄嘌呤（8）和 2-哌啶酮（9）。所有化合物均为首次从该药材中分离得到。

1 仪器与材料

Bruker AV-300 MHz核磁共振波谱仪（瑞士Bruker公司）;Agilent 6210 LC/MSD TOF质谱仪（美国Agilent公司）;Agilent-1260分析型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）;Agilent-1260制备型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；薄层层析用硅胶GF254薄层预制板（烟台化学工业研究所）；柱色谱用硅胶（青岛海洋化工厂），Sephadex LH-20（Pharmacia公司），ODS柱层析材料（德国Merck公司）；高效液相色谱及质谱仪分析使用试剂为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

水蛭药材于2011年3月购于广东省清平药材市场，由暨南大学药学院周光雄教授鉴定为水蛭科蚂蟥的干燥全体。药材标本（编号20110325）保存于暨南大学中药及天然药物研究所。

2 提取与分离

干燥的水蛭全体4 kg粉碎后用95%乙醇在80℃下回流提取3次，合并提取液，减压回收溶剂，得到总浸膏460 g，将总浸膏用适量水混悬后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到相应部位的萃取物。乙酸乙酯萃取物（40 g）经硅胶柱层析，氯仿/甲醇（100∶0-1∶1）梯度洗脱，经 TLC 分析合并，得到9个馏分（Fr.1-6）。馏分Fr.2（3.2 g）进一步经硅胶柱层析分离及Sephadex LH-20凝胶柱（氯仿-甲醇）分离纯化得到化合物 1（9.3 mg）、2（5.3 mg）。馏分Fr.3（9.7 g）经 ODS 柱层析，甲醇/水（40∶60-100∶0）梯度洗脱，TLC检测，得到4个馏分Fr.3.1～Fr.3.4。Fr.3.2经Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化得到化合物 3（6.3 mg）、4（7.2 mg）。Fr.3.3（300 mg）经高效液相色谱制备，以甲醇/水（60∶40）为流动相，分离纯化得到化合物 5（6.5 mg）、6（5.9 mg）、7（8.1mg）。馏分 Fr.5（3.7 g）经 ODS 柱层析，甲醇/水（40∶60-100∶0）梯度洗脱及 Sephadex LH-20凝胶柱（氯仿-甲醇）分离纯化得到化合物 8（6.6 mg）、9（5.9 mg）。

3 结构鉴定

化合物 1：淡黄色油状物。UV（MeOH）λmax:212、228、282 nm。ESI-MSm/z 346[M+Na]+,分子式为C15H17NO7;1H-NMR （300 MHz,CD3OD）δ:8.10（1H,m,H-4）,8.07（1H,s,H-2）,7.46（1H,m,H-7）,7.22（1H,m,H-6）,7.20（1H,m,H-5）,5.74（1H,d,J=7.9,H-1′）,3.88 （1H,dd,J=12.1,1.9 Hz,H-6′a）,3.72（1H,dd,J=12.1,4.6 Hz,H-6′b）,3.54（1H,m,H-2′）,3.53（1H,m,H-3′）,3.47（1H,m,H-5′）,3.44（1H,m,H-4′）；13C-NMR （75 MHz，CD3OD）δ:134.4 （C-2）,107.7（C-3）,122.1（C-4）,122.9（C-5）,124.1（C-6）,113.2（C-7）,138.4（C-8）,127.6（C-9）,165.8（C-10）,95.5（C-1′）,78.9（C-2′）,78.4（C-3′）,74.3（C-4′）,71.3（C-5′）,62.6（C-6′）。以上数据与文献[8]报道对照基本一致，故鉴定化合物1为吲哚-3-甲酸-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物 2：淡黄色粉末。UV（MeOH）λmax:208、242、258、296 nm。ESI-MSm/z146[M+H]+,分子式为C9H7NO;1H-NMR（300 MHz,D2O）δ:7.64（1H,m,H-5）,7.51（1H,m,H-8）,7.27（1H,m,H-2）,7.21（1H,m,H-7）,4.09（1H,m,H-1）,3.57（1H,dd,J=10.4,4.6 Hz,H-3）,3.15（1H,m,H-4a）,2.81（1H,m,H-4b）；13C-NMR（75 MHz,D2O）δ:139.9（C-2）,120.3（C-3）,125.2（C-4）,122.5（C-5）,123.8（C-6）,113.3（C-7）,139.1（C-8）,125.9（C-9）,187.6（C-10）。以上数据与文献[9-10]报道对照基本一致，故鉴定化合物2为3-吲哚-甲醛。

化合物 3：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、220、268 nm。ESI-MS m/z 268 [M+H]+,分子式为C10H13N5O4;1H-NMR （300 MHz,CD3OD）δ:8.34（1H,s,H-8）,8.13（1H,s,H-2）,7.33（2H,s,NH2-6）,5.87（1H,d,J=6.2 Hz,H-1′）,5.48 （1H,m,OH-2′）,5.42（1H,m,OH-5′）,5.23（1H,m,OH-3′）,4.60（1H,m,2′）,4.14（1H,m,3′）,3.96（1H,m,4′a）,3.67（1H,m,5′a）,3.55（1H,m,5′b）；13C-NMR（75 MHz,CD3OD）δ:152.4（C-2）,149.0（C-4）,119.3（C-5）,156.1（C-6）,139.9（C-8）,87.9（C-1′）,73.4（C-2′）,70.6（C-3′）,85.9（C-4′）,60.7（C-5′）。以上数据与文献[11]报道对照基本一致，故鉴定化合物3为腺苷。

化合物4：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、248nm。ESI-MSm/z291[M+Na]+,分子式为C10H12N4O5;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:8.29（1H,s,H-8）,8.18（1H,s,H-6）,6.06（1H,d,J=5.8 Hz,H-1′）,4.77（1H,dd,J=5.8,5.2 Hz,H-2′），4.43 （1H,dd,J=5.2,3.8 Hz,H-3′）,4.28（1H,m,H-4′）,3.93（1H,dd,J=12.8,2.9 Hz,H-5′a）,3.80 （1H,dd,J=12.8,3.9 Hz,H-5′b）；13CNMR（75 MHz,CD3OD）δ:160.2（C-2）,148.5（C-4）,124.1（C-5）,147.4（C-6）,139.9（C-8）,88.3（C-1′）,70.4（C-2′）,73.9（C-3′）,85.5（C-4′）,61.3（C-5′）。以上数据与文献[12]报道对照基本一致，故鉴定化合物4为2-羟基嘌呤核苷。

化合物5：白色粉末。UV（MeOH）λmax:208、262nm。ESI-MSm/z267[M+Na]+，分子式为C9H12N2O6;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:7.86（1H,d,J=8.1 Hz,H-6）,5.89（1H,d,J=5.4 Hz,H-1′）,5.87（1H,d,J=8.1,H-5）,4.34（1H,dd,J=5.4,4.6 Hz,H-2′）,4.22（1H,t,J=5.4，5.4 Hz,H-3′）,4.12 （1H,m,H-4′）,3.91（1H,dd,J=12.8,2.9 Hz,H-5′a）,3.80（1H,dd,J=12.8,4.3 Hz,H-5′b）；13C-NMR（75 MHz,CD3OD）δ:154.7（C-2）,166.3（C-4）,102.2（C-5）,141.7（C-6）,89.3（C-1′）,73.6（C-2′）,69.3（C-3′）,84.1（C-4′）,60.7（C-5′）。以上数据与文献[13]报道对照基本一致，故鉴定化合物5为尿嘧啶核苷。

化合物6：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、260nm。ESI-MSm/z 136[M+H]+,分子式为C5H5N5;1H-NMR（300 MHz,D2O）δ:7.99（1H,s,H-2）,7.92（1H,s,H-8）；13C-NMR（75 MHz,D2O）δ:154.0（C-2）,150.4（C-4）,118.1（C-5）,155.2（C-6）,147.4（C-8）。以上数据与文献[14]报道对照基本一致，故鉴定化合物6为腺嘌呤。

化合物 7：白色粉末。UV（MeOH）λmax:206、258 nm。1H-NMR （300 MHz,DMSO-d6）δ:11.00（1H,s,H-3）,10.80（1H,s,H-1）,7.38（1H,d,J=6.9 Hz,H-6）,5.45（1H,d,J=6.9Hz,H-5）；13C-NMR（75 MHz,DMSO-d6）δ:151.6（C-2）,164.4（C-4）,100.3（C-5）,142.2（C-6）。以上数据与文献[15]报道对照基本一致，故鉴定化合物7为尿嘧啶。

化合物 8：淡黄色粉末。UV（MeOH）λmax:204、262 nm。ESI-MS m/z 151 [M-H]+,分子式为C5H4N4O2;1H-NMR（300 MHz,DMSO-d6）δ:7.82（1H,s,H-8）;13C-NMR（75 MHz,DMSO-d6）δ:151.8（C-2）,149.4（C-4）,107.9（C-5）,156.0（C-6）,140.8（C-8）。以上数据与文献[16]报道对照基本一致，故鉴定化合物8为黄嘌呤。

化合物 9：淡黄色油状物。UV（MeOH）λmax：206 nm。ESI-MSm/z100[M+H]+,分子式为C5H9NO;1H-NMR（300 MHz,CD3OD）δ:3.27（2H,m,H-6）,2.30（2H,m,H-3）,1.79（2H,m,H-4）,1.76（2H,m,H-5）；13C-NMR （75 MHz,CD3OD）δ:175.1 （C-2）,32.1（C-3）,21.8（C-4）,23.2（C-5）,43.1（C-6）。以上数据与文献[17]报道对照基本一致，故鉴定化合物9为2-哌啶酮。