传统发酵大豆制品挥发性成分和微生物多样性的研究进展

张鹏飞，乌日娜，武俊瑞*

（沈阳农业大学 食品学院，辽宁 沈阳 110866）

大豆制品简称豆制品，是以大豆为主要原料经过加工制作或精练提取而得到的产品[1]。按照生产工艺的方法可以把豆制品分为两类，一类是传统豆制品，另一类为新兴豆制品。传统豆制品分为发酵豆制品和非发酵豆制品。发酵豆制品是指经过一个或几个特殊的生物发酵过程，产生具有特定的形态和风味的产品，主要包括豆酱、豆豉、腐乳和酱油等；非发酵豆制品是指经过清洗、浸泡、磨浆、出渣、煮浆及成型工序，产生具有一定物态的大豆制品，主要包括经熏制、卤制和冷冻等过程制成的产品。现阶段，非发酵豆制品在市场中占主导地位。新兴豆制品因合理的生产工艺兴起于20世纪中期，其自动化、工业化程度高，不同产品的工艺性能可以适应食品工业的各种需要，主要包括蛋白类制品、油脂类制品、全豆类制品和功能保健类制品，功能保健类豆制品是目前研究的热点[2]。

大豆食品在我国已有几千年的生产历史，是我国人民膳食结构的重要组成部分，而传统大豆发酵食品是体现我国民族特色的传统酿造产品，在弘扬我国传统文化，保障人民生活品质等方面发挥着独特的作用。豆酱、豆豉、腐乳和酱油是我国四大传统大豆发酵食品，它们因营养丰富、风味独特而被广大消费者接受[3]。虽然目前国内外对传统发酵豆制品已有相关报道，但是对传统发酵豆制品之间的对比研究还相对较少。因此，如何将传统发酵豆制品之间联系起来，研发出工业化程度高、营养丰富仍保留良好风味的新产品，是目前研究的热点，同时对提高企业积极性，实现整个豆制品行业的清洁生产具有重大意义。本文对四大传统发酵豆制品的挥发性成分和微生物多样性最新研究进展进行了总结，揭示挥发性成分与微生物的变化规律及其之间的关系，同时找出它们的差异，为今后大豆发酵食品的工业化、标准化及发酵菌种的选育提供理论参考。

1 豆酱

豆酱作为我国传统发酵豆制品之一，以大豆为主要原料，经霉菌、酵母菌和乳酸菌等多种微生物协同发酵而成[4]，其营养物质丰富，含有蛋白质、蛋白黑素、肽类、大豆异黄酮等多种有益人体健康的活性物质，具有极好的保健功能[5]。豆酱的生产分两个阶段，包括固态制曲和液态发酵[6]，在这两个发酵过程中，大豆蛋白质在微生物分泌酶的作用下，通过一系列生化反应，其中包括蛋白质水解、酒精发酵、有机酸发酵、脂类形成等产生其独特的香味和色泽[7]。

1.1 豆酱的挥发性成分

挥发性成分作为豆酱风味的重要组成部分，对豆酱的总体可接受性起到了决定性作用。近年来，国内外对豆酱的挥发性成分分析取得了一定的进展，而采用最广泛的方法就是顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS-SPME）结合气-质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。

JEONGDW等[8]采用GC-MS结合主成分分析（principal componentanalysis，PCA）的方法分析接种不同起始微生物对豆酱挥发性成分的影响，共鉴定出22种挥发性成分，主成分分析表明屎肠球菌和嗜盐四联球菌产生了与对照组类似的挥发性化合物，豆酱风味没有显著差异，地衣芽孢杆菌和腐生葡萄球菌能产生区分于对照组明显的挥发性化合物；赵建新等[9]采用HS-SPME结合GC-MS方法对马鞍山某公司生产的酱醅进行研究，共分离鉴定出传统豆酱中的挥发性风味化合物136种，含量最高的两类化合物是醇和酸，但酯类物质则是豆酱香气的主体成分；乔鑫等[10]采用HS-SPME吸附并结合GC-MS的方法对工厂化生产豆酱和传统酿制豆酱进行分析研究，共鉴定出化合物61种，工厂化生产豆酱和传统酿制豆酱分别为39种和38种，主要包括酯、醇、酚和醛类化合物等，相对于工业化生产豆酱，传统酿造豆酱在色泽、气味和体态方面均占绝对优势；庞惟俏等[11]采用HS-SPME并结合GC-MS的方法对东北两份豆酱样品进行分析，均检出42种挥发性成分，其中共有20种挥发性成分，挥发性成分以酯类和醇类含量最高，醇酯类化合物种类和含量的不同是造成香气存在差异的主要原因；孟鸳等[12-13]采用HS-SPME并结合GC-MS的方法，测定发酵阶段处于不同光照条件下酿制的甜面酱成品的挥发性成分。结果表明，酯类、醛类和烃类的形成与光照有密切联系，交替光照影响酯类合成，整日光照影响醛类和烃类的合成；整体上看，交替光照对于甜面酱挥发性成分的形成最为有利；利用气质联用技术对同时蒸馏萃取、溶剂萃取和顶空-固相微萃取3种方法的萃取成分进行分析鉴定比较，利用GC-MS共鉴定出化合物60种，挥发性的酯、醛以及含氮、含硫化合物构成了甜面酱风味的主体。并且同时蒸馏萃取法对甜面酱中高沸点化合物，如醛类有较好的萃取效果；溶剂萃取法则对酸类的提取效果较好；顶空固相微萃取法有利于提取易挥发性化合物，特别是对挥发性酯和烯烃类的提取更加有效；康旭等[14]利用GC-MS技术，对是否添加酵母菌发酵的黄豆酱进行检测分析，得出添加酵母菌能明显增加黄豆酱中挥发性成分的种类。综上可以看出，酯类、醇类、酸类和醛类化合物是豆酱挥发性成分的关键物质，而这些物质的含量与多种因素有关。豆酱的品质由豆酱的挥发性成分决定，而豆酱的挥发性成分又与豆酱的生产环境息息相关[15]，因此研究豆酱的挥发性成分对于豆酱的质量和生产工艺有重要参考意义。

1.2 豆酱微生物多样性

目前，我国传统发酵豆制品大多采用粗放式和手工作坊式的天然多菌种混合发酵，产品质量参差不齐，因此要生产质量稳定的产品就必须依赖于固定的生产工艺和明确的微生物发酵剂[16]。随着科学技术的进步，各种分子生物学技术孕育而生，为研究传统发酵食品微生物多样性提供了便利的途径。

张颖等[17]采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophore sis，PCR-DGGE）技术结合高通量测序方法对东北传统自然发酵豆酱发酵过程中细菌的多样性及动态变化进行分析，得出细菌的多样性随着发酵时间的变化而变化，发酵后21d达到最大值，明串珠菌属、肠球菌属、四联球菌属和乳杆菌属是豆酱样品不同发酵阶段的优势细菌菌属；JUNG J Y等[18]利用焦磷酸测序研究了韩国发酵豆酱酱醅中微生物的动态变化，研究表明芽孢杆菌和毛霉是酱醅发酵过程中细菌和真菌的优势菌群，发酵体系内外部环境中细菌的差异对发酵结果有较大影响，而真菌影响相对较小，发酵使用水中真菌的差异是体现真菌发酵作用的一个关键指标；豆酱中代谢产物的产生与其中的发酵微生物密切相关；LEE S等[19]提取豆酱中微生物脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA），借助PCR-DGGE技术分析其中的微生物多样性，通过气相色谱-飞行时间-质谱（gaschromatography time-of-flight mass spectrometry，GC-TOF-MS）和高效液相色谱-串联电喷雾-质谱法（highperformanceliquidchromatography-electrospray ionization-mass spectrometry，LC-ESI-MS）对豆酱样品进行代谢组学分析，最终对微生物多样性结果和代谢组学分析结果进行相关性分析，探究豆酱中发酵微生物与代谢产物之间的关系，结果表明糖代谢与米曲霉密切相关、脂肪酸代谢与芽孢杆菌密切相关、氨基酸代谢与接合酵母和嗜盐四联球菌密切相关。第二代测序技术在近几年发酵食品研究中起到了重要作用，随着研究内容的深入以及人们对生活质量要求的提高，如何让传统特色产品成为生活的必备品是接下来研究的关键问题。

2 豆豉

豆豉是以黄豆或黑豆为原料，在微生物共同作用下，分解原料中的各种成分，产生具有特殊风味的发酵大豆制品[20]。根据豆豉制曲的主导微生物种类的不同，豆豉可分为：曲霉型豆豉、毛霉型豆豉、根霉型豆豉及细菌型豆豉[21]。豆豉具有一定的食用价值和药用价值，具有预防心脑血管疾病、提高免疫力、抗疲劳及减少衰老等功效[22]。

2.1 豆豉的挥发性成分

近几年，随着气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）的发展，许多学者都对豆豉中的挥发性成分进行了研究，鉴定出了不同豆豉的挥发性成分及特征性香气成分。汤启成等[23]采用HS-SPME和GC-MS方法分析测定毛霉型豆豉与曲霉型豆豉的挥发性成分，并对其进行比较分析，结果表明，毛霉型豆豉与曲霉型豆豉挥发性成分种类分别有88种和68种，两种豆豉中相同的物质有14种；何桂强等[24]也采用相同技术分析了毛霉型和曲霉型豆豉的挥发性组分特征，结果表明，毛霉型豆豉的酯类、酸类、醛类、醇类、酮类、酚类和吡嗪类化合物含量显著高于曲霉型豆豉，毛霉型豆豉可能有更强烈的酸味、甜香味、玫瑰花香味、蘑菇香味和烟熏味；刘毕琴等[25]在前人研究的基础上，对细菌型豆豉的风味物质进行归类总结得出：酸类含量最高，其次是杂环化合物（主要是吡嗪），醇类第三，而酯类化合物、羰基化合物（包括醛和酮）和含硫化合物则相对较少，同时研究表明，乳酸菌的加入可以提高细菌型豆豉的风味；宋园亮[26]将乳酸菌添加到由枯草芽孢杆菌单独发酵的豆豉中，发现乳酸菌，尤其是植物乳酸菌能显著减少由纯种枯草芽孢杆菌发酵豆豉所产生的氨味，使豆豉具有浓厚的酯香，感官评价中接受度最好；FENG X M等[27]利用GC-MS方法分析了不同根霉对豆豉发酵过程中风味物质的影响，结果表明，不同菌株对结果影响较小，根霉与植物乳酸菌共同发酵同样不影响挥发性物质的含量，根霉型豆豉的主要挥发性物质为乙醇、丙酮、乙酸乙酯和2-丁酮等。综上所述，不同类型的豆豉其主体香不同，而酸类、酯类及杂环类化合物在不同豆豉中均普遍存在，是豆豉挥发性成分的关键成分。豆豉作为我国传统发酵调味品，因地域差异导致风味差异较大，这些都限制了豆豉的工业化生产，仍需利用新技术、新手段对豆豉的发酵机理、豆豉发酵过程中新陈代谢的规律以及风味物质形成机制进行深入的研究，为其工业化生产奠定基础。

2.2 豆豉微生物多样性

传统发酵食品因独特的风味而被人们喜爱。豆豉风味物质的形成，除了受原料本身差异外，更重要的是豆豉在发酵过程中豆曲产生的酶系，如脂肪酶、蛋白酶以及淀粉酶等，将原料中的脂肪、蛋白质和淀粉等分解为各种小分子物质。因此，研究豆豉发酵过程中微生物组成及变化规律，对于了解发酵过程至关重要。目前，国内外对豆豉发酵过程中微生物的结构及变化规律已有些报道。

SEUMAHU C A等[28]利用扩增核糖体基因间测序分析（amplified ribosomal intergenic sequence analysis，ARISA）技术分析了不同根霉型豆豉发酵过程中细菌和真菌的多样性，结果表明：细菌和真菌在不同发酵过程中多样性不同，整体来看细菌的多样性高于真菌多样性，细菌对发酵结果起关键作用；EFRIWAT I等[29]利用末端限制性片段长度多态性（terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）技术研究了酵母菌和乳酸菌在豆豉发酵过程中的群落变化情况，研究表明不同方法生产的豆豉酵母菌和乳酸菌结构差异较大，不同地区同一类型的豆豉酵母菌和乳酸菌也存在差异；李晓然等[30]采用焦磷酸测序技术对云南省两个地区的豆豉样品微生物多样性进行比较发现，两份样品的优势细菌为肠膜明串珠菌和金黄色葡萄球菌，而两份样品的优势真菌都是耐盐假丝酵母菌；孙森等[31]对自制的天然发酵豆豉的后发酵阶段的微生物进行了初步鉴定，认为豆豉后发酵中的主要微生物为酵母菌和细菌（包括芽孢杆菌和乳酸菌），其次为霉菌，意味着霉菌在后发酵中已不是占主导位置的微生物，但是霉菌在前发酵中产生的各种酶类，在后期仍然发挥着重要的作用；总体来讲，毛霉、曲霉、根霉、乳酸菌、片球菌、微球菌、芽孢杆菌及酵母菌是豆豉发酵过程中常见的菌种。为实现多菌纯种发酵，确保豆豉的质量安全，因此进行豆豉中微生物多样性及变化规律的研究就显得十分的重要，相信在不久的将来，在新技术的指导下，可以更加全面而准确地展示样品的微生物群落结构。

3 腐乳

腐乳作为我国一种传统发酵豆制品，已有1 500多年的历史，它以黄豆为主要原料，水、盐等为辅料，经一系列过程发酵而成的一种佐餐品，根据其色泽风味可分为红方腐乳、白方腐乳、青方腐乳及其他腐乳[32]，无论哪种腐乳，其发酵过程均是利用微生物产生的酶类分解原料中的大分子物质生产小分子物质的生化过程，这一过程使其形成了独特的风味和丰富的营养。

3.1 腐乳的挥发性成分

腐乳的挥发性成分是在发酵贮藏过程中形成，微生物代谢产生的小分子化合物和加入的辅料共同形成了腐乳独特的风味。目前，国内外主要采用HS-SPME结合GC-MS的方法研究腐乳中的挥发性成分。

卢靖等[33]采用HS-SPME结合GC-MS方法对腐乳发酵过程不同时期的挥发性风味成分进行分析，共鉴定出化合物110种，不同发酵时期腐乳挥发性风味成分差异明显，随着发酵的进行，挥发性风味成分的种类逐渐增多。在前发酵过程中，醛类相对含量显著降低，酯类、醇类相对含量以及种类逐渐增大；在后发酵过程中，随着后发酵时间的延长，醛类、酸类、酯类相对含量逐渐升高，烃类、醇类相对含量逐渐降低；黄明泉等[34]采用GC-MS方法对北京地区的2种王致和腐乳和3种老才臣腐乳的挥发性成分进行了比较分析，研究表明5种腐乳挥发性成分差别较大，共鉴定出93种挥发性成分，对腐乳的香味贡献较大的是酯类，如己酸乙酯和庚酸乙酯等；MOY Y S等[35]采用GC-MS方法研究了发酵腐乳与非发酵豆坯的挥发性成分，研究表明发酵腐乳相对于豆坯有较多的挥发性物质，发酵前期主要挥发性成分是脂肪酸、醛和酯，而成熟阶段主要挥发性物质为酯和醇。由于不同地区不同产品之间差异较大，很难去实现腐乳的大规模生产，这也是影响腐乳产业发展的重大难题，此后，应加大研究力度，全面系统的解析发酵过程，从而为工业化、标准化生产打好理论基础。

3.2 腐乳微生物多样性

传统腐乳发酵生产分为前发酵和后发酵两个阶段，其发酵过程是一个复杂的生化过程，主要是利用微生物产生的酶类分解原料中的大分子物质，目前国内外对腐乳的研究主要集中在不同品牌之间微生物的差异分析、指定菌种在发酵过程中的作用以及益生菌的筛选应用方面。

陈颖慧[36]以不同腐乳品牌为研究对象，采用PCRDGGE技术对成熟腐乳的细菌多样性分析比较。结果表明，克东牌腐乳的细菌多样性最低，广合牌腐乳的细菌多样性最高，乳酸杆菌属是腐乳中细菌的优势菌群，乳酸菌属、藤黄微球菌和粪肠球菌为4种品牌腐乳的共有菌株，融合魏斯氏菌、瑞士乳杆菌和乳酸链球菌存在于老才臣牌腐乳、广合牌腐乳和王致和牌腐乳中，植物乳杆菌和发酵乳杆菌存在于广合牌腐乳和王致和牌腐乳中，玫瑰考克氏菌只存在于克东牌腐乳中，而醋酸钙不动杆菌只存在于王致和牌腐乳中，可知不同品牌腐乳中细菌的多样性存在着差异；凃婧等[37]总结前人的结果得出，腐乳生产过程中使用最多的微生物是毛霉，大约占90%～95%，市面上常用的毛霉菌种有通桥毛霉、总状毛霉、雅致放射毛霉和腐乳毛霉；此外，芽孢杆菌、微球菌、米根霉和少根根霉也存在于其他类型发酵腐乳中。

腐乳因丰富的营养物质、质构类似于干酪，被西方人誉为“东方奶酪”[38]。随着科技的发展和研究的深入，腐乳的开发研究将具有更广阔的发展应用前景。

4 酱油

酱油是由酱演变而来的一种中国传统调味品，它以黄豆、小麦及麸皮为主要原料经微生物发酵酿造而成。酱油颜色为红褐色，有独特的酱香味，滋味鲜美，有助于促进食欲[39]。目前，我国酱油生产主要采用高盐稀态发酵和低盐固态发酵两种方法，研究酱油的挥发性成分和微生物多样性对酱油的行业发展有一定推动作用。

4.1 酱油挥发性成分

酱油的酿造过程经历了多次的微生物区系更迭，风味的来源是由微生物引起的一系列生化变化而形成，多种微生物交织在一起的共同作用形成酱油独特的酱香味。目前，国内外学者对酱油的挥发性成分已经有较深入了解。

刘贞诚[40]利用HS-SPME结合GC-MS的方法对不同原料酱油、不同发酵时期酱油和灭菌前后酱油的风味成分进行分析，研究表明不同原料发酵产出的酱油风味成分不同（主体香气成分不同），随着时间的增加，酱油的风味成分越来越多，由单一的醇类变化为醇类、酯类以及杂环类等，而灭菌酱油相对于未灭菌的酱油风味成分有所下降，这些都为工业化指导做出了积极的贡献；袁江兰等[41]利用鲁氏酵母和曲霉联合发酵米渣生酱油，评价其对产品风味的影响，结果表明鲁氏酵母明显提高了米渣生酱油谷氨酸、5-甲基-2-乙基-4-羟基-3（2H）-呋喃酮（4-hydroxy-2-ethyl-5-methyl-3（2H）-furanone，HEMF）、4-乙烯基愈创（4-vinylguaiacol；4-VG）含量；FENG Y Z等[42]采用HS-SPME结合GC-MS方法分析了高盐稀态发酵和低盐固态发酵豆酱的香气成分，得出高盐稀态发酵比低盐固态发酵香气成分更加丰富，乙醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚和3-（甲硫基）丙醛是高盐稀态发酵酱油的主体香，3-甲基丁醛、苯乙醛和丙酸乙酯是低盐固态发酵酱油的主要香气成分；冯笑军等[43]采用GC-MS法对酿造酱油和配制酱油的挥发性成分进行比较，发现酿造酱油中醇、酚、醛酮、酯类物质的种类均比配制酱油多，但配制酱油的杂环类风味物质比较丰富，同时不同原料不同工艺会对酿造酱油的风味物质产生影响；FENG Y Z等[44]分析了不同工艺对酱油挥发性成分的影响，发现不同工艺对酱油的挥发性物质种类影响不大，但相同物质在不同酱油中含量差别较大，酸类物质在低盐固态发酵酱油中含量较高，酯类和酚类物质在日本酿造酱油中含量较高。总的来说，液态发酵比固态发酵更利于酱油中大分子物质的降解。当前我国大部分酱油产品制造技术仍大多沿袭传统工艺，尽管在改造酱油产品工业的过程中采用了一些现代化技术，但对于发酵酱油的工艺机理，尤其是微生物的代谢过程缺乏深刻认识和系统研究。

4.2 酱油微生物多样性

酱油发酵经过多种微生物共同作用形成其独特的香味，每种微生物在酱油酿造过程中不同时段的具体作用很难确切描述，尤其是酱油的固态敞开式发酵的独特工艺形成了其特殊的微生物区系，使得微生物之间的相互作用更加复杂。随着科学技术的日益完善，越来越多的研究者剖析酱油发酵过程微生物的动态变化。

谢显华[45]利用PCR-DGGE技术对整个酱油发酵过程微生物群落结构的演变规律进行分析得出，微生物菌落结构随着发酵时间的变化而变化，魏斯菌属从成曲到发酵期结束显现较明显的菌群优势，类肠膜魏斯氏菌，发酵乳杆菌及肠杆菌属，它们的数量随发酵时间的增长而逐渐减少，整个酱油发酵过程微生物群落结构的变化规律是由复杂到简单；HARADA R等[46]利用代谢组学结合GC-MS方法分析了酵母菌和乳酸菌对酱油发酵过程的影响，它们的加入影响其他微生物的代谢过程，从而影响了酱油的风味，但是对酱油的品质产生了积极地效果；YAN Y Z等[47]采用纯培养和非纯培养的方法研究了豆酱发酵过程细菌和真菌的多样性，研究表明不同的方法分析得出的微生物组成不同，但是起主要功能的微生物大致一致，最主要的细菌是魏斯氏菌（Weissella）和葡萄球菌（Staphylococcus），最主要的真菌是曲霉属（Aspergillus）和假丝酵母（Candida）；SULAIMAN J等[48]采用宏基因组学也得出了相同的结论。酱油产品具有独特风味和区域特色与当地的微生物区系密切相关，微生物与微生物的相互作用及微生物与原料的相互作用将是接下来研究的焦点问题。

5 总结及展望

传统大豆发酵制品因其独特的风味和丰富的营养而受到广大科研工作者的关注。发酵菌种、发酵原料、发酵时间的长短及环境条件的不同均影响发酵结果的成败，而发酵后的产品生理功能明显优于未发酵的产品，因此，这就需要在长期摸索中不断提升发酵豆制品的生产水平，在保持其良好风味的同时，尽可能的使其工业化、规模化和标准化生产。

食品营养是健康的重要基础，随着对发酵豆制品促健康作用的不断深入，人们对于发酵豆制品的消费理念不再局限于调味品范畴，功能性发酵豆制品成为人们关注的焦点。豆制品作为食品行业的重要组成部分，具有良好的发展潜力，在继承传统的基础上充分利用现有科技水平，保持传统发酵豆制品的市场活力。