细菌降解黄曲霉毒素B1的研究进展

严家俊，庄艺协，吴风霞，金佳佳，张 娟

（1.广东产品质量监督检验研究院，广东 佛山 528300；2.中国水产科学研究院 南海水产研究所，广东省渔业生态环境重点实验室，广东 广州 510300）

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一组由二呋喃环和香豆素的组成的结构类似物[1]，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等有机溶剂，难溶于水。其主要是由黄曲霉（Aspergillusflavus）、寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等多种真菌产生的具有强毒性和致癌性的次级真菌代谢产物[2]，目前已发现的黄曲霉毒素有二十余种，常见的有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1，其中黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最强，具有强肝毒性，低剂量可抑制动物免疫机能，使消化系统紊乱，高剂量会诱发癌变甚至死亡，因而被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物质[3]。其广泛分布于农产品及饲料食品中，加之因毒素污染导致动物中毒，不但对粮食和畜牧业造成严重的经济损失，对人类及动物的健康也存在巨大的威胁。由于黄曲霉毒素所带来的巨大经济损失和健康危害，众多研究学者致力于寻求有效的防治技术，其中生物防治是一种行之有效的方法。其中，研究发现微生物能够降低黄曲霉毒素含量，其中包括细菌、真菌及酵母菌等。本文对细菌降解黄曲霉毒素B1进行综述，并对其研究结果进行初步分析，以期为接下来的机理研究提供基础材料。

1 黄曲霉毒素B1的去毒方法

国内外专家学者现已对AFB1去毒进行了大量的研究，主要有化学法、物理法和生物法[4]。物理脱毒方法主要包括吸附剂吸附法、水洗法、剔出法、脱胚去毒法、溶剂提取法、加热去毒法和紫外线去毒法等，其中最常用的是吸附剂吸附法，但吸附剂吸附毒素的同时也会吸附饲料中的营养物质。化学脱毒的方法主要采用碱或氧化剂进行脱毒，包括石灰水浸泡法、氨水脱毒法以及氧化剂脱毒法，其基本原理是霉菌毒素在强酸或者强碱的作用下转化为无毒的物质。然而这些方法存在效果不稳定、脱毒不完全、化学物质残留会导致营养物质和微量元素的流失、难以规模化生产等缺点。而生物法主要包含生物吸附法和生物降解法。生物吸附法主要是微生物通过细胞壁吸附毒素而不是共价结合，死亡细胞仍具有结合能力。这种结合是一个可逆的过程，虽然能有效吸附毒素，但随着培养时间的延长，部分毒素会重新释放到培养基质中。而生物降解主要是将AFB1的毒性基团分解破坏，同时产生低毒或者无毒的降解产物的过程，是一种化学反应的过程，完全不同于吸附结合作用。

2 菌株发酵条件对降解黄曲霉毒素B1的影响

微生物的物质代谢和能量代谢受外界环境条件（如温度、pH值及培养基组成等）的影响较大。适宜的外部条件不仅对菌体的生长有利，还可以提高其对底物的利用能力，使其代谢反应向着有利于合成目标产物的方向进行。因此会出现菌体具有AFB1降解能力，但是降解率不够高的情况。针对这一问题，众多学者对发酵条件进行优化研究，以期达到提高AFB1降解率的目的，为目的菌株的工业化应用提供参考。李俊霞等[5]通过对目的菌株进行发酵培养基和培养条件优化，黄曲霉毒素的降解率从84.2%升高至94.29%，优化效果明显。戴军等[6]通过单因素试验，对目标菌株产酶发酵条件进行优化，所得最佳条件为装液量50 mL/250 mL，发酵周期48 h，初始pH5.0，接种量8%，发酵温度37℃，摇床转速160 r/min。在最佳发酵条件下，该菌株发酵上清液中的酶活性比优化前提高了23.7%。杨文华等[7]在单因素试验的基础上，通过3因素3水平的Box-Behnken响应面分析法优化施氏假单胞菌发酵产AFB1降解酶的条件。在优化后的条件下，酶活力比优化前提高了28.99%。王宁等[8]通过单因素试验和正交试验对一株具有降解AFB1活性的黏细菌的产酶条件进行优化，得到最优的培养基以及培养条件，在最佳培养基和最佳发酵条件下，该菌株降解AFB1的能力为78.2%。刘睿杰等[9]采用响应面法研究巨大芽孢杆菌固态发酵去除花生粕中AFB1的发酵条件，确定其最佳条件为料水比1∶1.1，发酵温度35.90℃，发酵时间64.32h。在此条件下，AFB1降解率可达68.54%。

3 细菌降解黄曲霉毒素B1的作用机理研究

目前，针对细菌降解AFB1的研究发现，其主要作用机理是通过分泌降解酶与食品中的毒素反应，从而达到解毒的目的。本文将从细菌降解AFB1的作用机理出发进行综述，通过对细菌胞内酶降解、胞外酶降解等方面研究结果进行归类分析，为接下来的研究提供基础。

3.1 胞外酶降解

关心等[10]以香豆素为唯一碳源，通过初筛和复筛，从鸡粪中分离出一株蔬菜芽胞杆菌，其上清液AFB1降解率可达83%，排除其胞体的吸附作用，初步推断其降解活性成分为细胞代谢产生并分泌至胞外的活性物质。TENIOLA OD等[11]研究发现，红串红球菌的胞外提取物在30℃的温度条件下对AFB1的降解率在90%以上，同时依据胞外提取物在热处理和蛋白酶处理后降解率大大降低，推断解毒过程为酶促反应。针对红串红球菌，ALBERTSJF等[12]也有相同的发现。中国农业大学动物营养国家重点实验室分别从发霉粮食、动物粪便、土壤等样品中提取筛选出26株降解黄曲霉毒素的菌株，其中嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、橙红色粘球菌（Myxococcus fulvus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、克雷伯氏菌（Klebsiella sp.）、短波单胞菌（Brevundimonas sp.）、霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、短状杆菌、纤维菌（Cellulosimicrobium sp.）和炭疽芽孢杆菌（Bacillusanthracis）降解率均＞75%。在最佳发酵条件下，橙红色粘球菌对AFB1的降解率达到80.7%。运用蛋白分离纯化技术分离纯化出MADE酶，分子质量大小为32 kDa，该酶在pH 6、35℃时活性最佳。而通过筛选优化的枯草芽孢杆菌的发酵上清液对AFB1的降解率达到80%[13-16]。孙玲玉[17]从泰山土壤中筛选出具有较高降解AFB1作用的枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌泰山株，其发酵后上清液对AFB1的降解活性最高，通过对解毒活性物质进行加热和蛋白酶K变性处理后，解毒活性显著降低，表明起解毒作用的活性物质是其分泌的一种胞外酶。戴军[18]以香豆素为唯一碳源从不同样品中筛选到27株能高效降解AFB1的微生物菌株，通过以不同菌株发酵上清液中AFB1降解酶活力高低为复筛条件，筛选到AFB1降解酶活性最高的一株菌株，经形态学、生理生化及系统发育学方法鉴定为Sinomonas sp.，并初步推断该酶为菌株分泌的胞外酶。这是国内第一次报道该菌属的菌能降解AFB1。徐铭乾等[19]从霉变花生粕中筛选出一株能高效降解AFB1同时抑制黄曲霉生长的菌株Bacillusamyloliquefacuens HSP-5，该菌株所产生的降解AFB1物质为胞外物质，通过非诱导作用产生，其对AFB1不同含量的霉变花生粕样品降解率均达到80%以上，且降解后样品中AFB1含量＜30μg/kg，符合国家对饲料中AFB1含量的限量要求。这些特性为其在食品等工业生物防治黄曲霉以及降解AFB1具有很高的研究价值。雷元培等[20]对枯草芽孢杆菌降解黄曲霉毒素的生物活性、抗菌性以及抗逆性进行研究，结果表明，起解毒作用的是一种胞外酶，同时对分泌的活性蛋白具有强解毒活性，特异性和作用效果温和等特点，适用于去除饲料中的黄曲霉毒素。FARZANEH M等[21]发现枯草芽孢杆菌UTBSP1对黄曲霉毒素具有较高的降解率，并通过实验研究证明这种降解反应受胞外酶的酶促反应调控。

细菌胞外酶对AFB1的降解作用在已有研究中显示出较高的降解率，均可达70%以上，甚至可高达90%以上。但对其降解后的研究均未深入进行，其降解后的产物是无毒的还是低毒的也未进行阐明，此外，如何提高胞外酶的纯度和产量，也是亟待解决的问题，因此有必要继续深入研究从而促进其广泛应用。

3.2 胞内酶降解

李超波等[22]成功从动物粪便中分离2株高效降解AFB1的菌株，其上清液作用甚微，而灭活细胞却失去活性，从而推测AFB1被胞内活性物质降解。李文明[23]通过不同培养及降解条件，研究了施氏假单胞菌F4对AFB1的酶解作用，并对降解产物进行了分离鉴定及致突变性测定，结果表明施氏假单胞菌F4能够降解AFB1的活性物质为生物酶，且该酶为非诱导性胞内酶。王雪妍等[24]从土壤中提取一株食醚红球菌，并通过薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）和酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）实验证明，该菌能降解AFB1，其含有的还原酶FDR家族蛋白FDR_Adt很可能是负责降解AFB1的功能。

细菌降解AFB1的主要活性物质是降解酶，根据其分泌后排放位置分为胞外酶和胞内酶，胞内酶的降解作用研究发现相对胞外酶的研究发现较少，细菌降解AFB1的作用机理是否主要是通过胞外酶的酶促反应，这一推断还需大量研究实验加以证明。

3.3 其他

李俊霞等[25]同样是以香豆素为唯一碳源筛选出了AFB1降解菌株嗜麦芽窄食单胞菌，后期毒理学试验证明活菌制剂在2.56×1010CFU/mL剂量以下不会引起急性毒性反应。岳晓禹等[26]通过对嗜麦芽窄食单胞菌菌体细胞溶液、胞内物质和胞外粗提液对AFB1进行降解实验，结果表明，其胞外粗提液的降解能力最强，降解率达到78.64%，胞内物质基本无降解能力，由此可知，该菌株降解AFB1的主要物质为来自胞外的代谢产物。张志敏等[27]从秦川牛瘤胃内容物中分离到一株降解AFB1的巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium），当接种量为5%和AFB1质量浓度为500μg/mL时，其降解率可达79%。该研究团队随后又从猪肠道及内容物中分离出一株甲基营养型芽孢杆菌，在相同条件下，降解率达到75.25%[28]。孙晓霞等[29]从农田、粮库、牛场的300个样品中筛选出AFM1降解率达到78.6%的菌株，并通过细胞形态、生理生化反应等鉴定该菌株为纤维化纤维微菌（Cellulosimicrobium cellulans），首次发现了纤维化纤维微菌对AFM1的降解功能。

上述研究虽然均筛选出降解菌株，但未对其降解机理进行相关研究或阐述，黄曲霉毒素是被降解还是被吸附也未置可否。对于乳酸菌，据现有的文献报道，其去毒机理主要是依靠菌体细胞的物理吸附，而不是实质的生物降解作用[39-45]。而吉小凤等[30]从肉鸡肠道中筛选到一株乳杆菌属的脱毒菌株，对约14μg/L的AFB1去毒率达到63.4%，HAMIDIA[31]分别从人体粪便和鲜奶中分离得到乳酸菌Lactobacillus pentosus和Lactobacillus beveris，并通过实验证实这两种菌对AFB1都具有一定的毒素结合能力。此外，AFB1于乳酸菌可通过形成复合物，降低AFB1对人体的危害，且复合物更容易排除体外，减少AFB1在人体内的积累[32]。虽然降解率相比已有研究报道不高，但考虑到其属于益生菌群，生物安全性高，因此具有一定的应用价值。

4 黄曲霉毒素B1降解菌活性产物的应用研究

在利用细菌降解AFB1的研究中，重点探讨了菌株的筛选和降解条件优化方面的研究，而在作用机理研究、降解产物结构分析和安全性评价等方面研究成果较少。岳晓禹等[26]对嗜麦芽窄食单胞菌降解AFB1活性产物的应用性质进行了初步研究，表明其来自胞外的代谢产物，分子质量大小为30 kDa，并确定了该活性物质的最适应用条件。RAO K R等[33]利用地衣芽孢杆菌CFR1的胞外成分对AFB1进行降解。并通过高效薄层色谱法（high performancethin layer chromatography，HPTLC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）和电喷雾质谱（electrospray ionization massspectrometry，ESI-MS） 分析发现，降解产物荧光性消失，这表明AFB1由于内酯环裂解被生物转化成与其结构不同的物质。LIU D L等[34]通过对假密环菌降解AFB1的研究发现AFB1被黄曲霉毒素氧化酶氧化为环氧化物，接着水解为AFB1-8,9-二氢二醇，最后打开呋喃环。CAOH等[35]也从假密环菌中纯化、鉴定黄曲霉毒素氧化酶，并通过HPTLC分析表明该酶打开了AFB1中的呋喃环。YU J[36]研究发现微生物降解AFB1过程中，会产生一种发荧光的化合物AFB2a（又称AFB1-W）[37]。TEUNISSONDJ等[38]通过向1日龄体质量为50 g的鸭子注入1200μg AFB2a，发现鸭子并未产生于其他黄曲霉毒素相同的症状，且AFB2a的毒性为AFB1的1/200。

5 展望

利用细菌对黄曲霉毒素进行高效降解进而减少并控制黄曲霉毒素的危害，具有环保、高效、无毒害等优点，是解决黄曲霉毒素污染的有效途径及研究热点。目前国内外使用细菌降解黄曲霉毒素在食品工业中的应用才刚刚起步。虽然近年来取得一定的研究成果，但是在研究中，多数更关注的是脱除菌株的筛选及脱除条件的优化。对降解产物的安全性以及降解菌株环境耐受性等方面的研究相对较少，若能有效地改善细菌脱除黄曲霉毒素过程中周期普遍较长以及在不同环境中脱除能力不稳定等问题，并将其应用到食品工业生产中。细菌对黄曲霉毒素的降解技术将会具有更重要的实际应用价值。

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