健脾益气摄血方及其拆方对辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流量影响研究

张雅月+田劭丹+祁烁

[摘要] 目的 觀察健脾益气摄血方及其拆方对辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流量的改善作用，探索不同治则对斑马鱼血流动力学的变化联系。 方法 将660尾72 h受精卵黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼随机分为正常对照组、模型对照组和实验药物A（健脾颗粒配方）、B（健脾益气颗粒配方）、C（健脾益气补血颗粒配方）、D（健脾益气补血摄血颗粒配方）组。每种药物设100、250、500、750、1000 μg/mL五个不同浓度组，每组30尾。先以A、B、C、D组不同浓度药物处理斑马鱼4 h，再用50 μmol/L辛伐他汀处理30 min，用心跳血流分析系统采集各组20尾斑马鱼血流影像，分析血流量，计算改善率。 结果 ①与模型对照组比较，A、B组各药物浓度组对辛伐他汀诱导的斑马鱼心脏出血模型的血流量改善均无效果；C、D组的500、750、1000 μg/mL药物浓度均能提高斑马鱼出血模型血流量改善率（P < 0.05）。②在改善辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流速度和血流量改善率方面，健脾益气补血摄血方1000 μg/mL优于健脾益气补血方。 结论 健脾益气补血摄血治则综合运用能够明显提高辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流量改善率，体现了“气为血之帅，血为气之母”的气血相关理论。

[关键词] 健脾益气摄血方；斑马鱼；心脏出血；血流量

[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）12（c）-0009-05

[Abstract] Objective To observe the effect of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Controlling Blood Formula on the blood flow of Simvastatin-induced zebrafish cardiac hemorrhage model and to explore the relationship among the hemodynamic changes of zebrafish by different treatment. Methods The fertilized egg of 660 72-hour Albino zebrafish in melanin allele mutation was randomly divided into the normal control group， the model control group and group A （Invigorating Spleen Granule Formulations）， B （Invigorating Spleen， Benefiting Qi Granule Formulations）， C （Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood Granule Formulations）， D （Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood， Controlling Blood Granule Formulations） with different concentrations （100， 250， 500， 750， 1000 μg/mL） of experimental drugs. Each group of 30. First， the zebrafish of group A， B， C， D were treated with different concentrations of drugs for 4 hours， and then with 50 μmol/L Simvastatin for 30 minutes. Next， through collecting blood flow imaging of the 20 zebrafish in each group by heartbeat blood flow analysis system， the blood flow was analyzed and the improvement rate was calculated. Results ①Compared with the model control group， different concentrations of drug groups in group A， B had no effects on the improvement of blood flow in Simvastatin-induced zebrafish hemorrhage model； however， 500， 750，1000 μg/mL of drugs in group C， D could significantly increase the improvement rate of blood flow in zebrafish hemorrhage model （P < 0.05）. ②In ameliorating the model's velocity of blood flow and its improvement rate， 1000 μg/mL of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood， Controlling Blood Formula was superior to that of Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Replenishing Blood Formula. Conclusion The comprehensive application of invigorating spleen， benefiting qi， replenishing blood， controlling blood can ameliorate the blood flow of Simvastatin-induced zebrafish cardiac hemorrhage model， which reflects the theory of “qi is the commander of blood and blood is the mother of qi”.endprint

[Key words] Invigorating Spleen， Benefiting Qi， Controlling Blood Formula； Zebrafish； Cardiac hemorrhage； Blood flow

血液是人体生命活动赖以生存的基本物质，因而具有重要的生理功能。按照中医理论，血液调控体现在血液的推动、贮藏、调节及统摄等方面。其中，推动和统摄功能为血液贮藏、调节提供保障。血液能够正常循行于脉道，内注五脏六腑，外滋四肢百骸，主要依赖气的推动和固摄功能。气的推动动力正常，血液才能运行不息；气的固摄功能正常，血液才能在脉管中循环不息，周而往复。如果推动和固摄功能失常就会出现血液瘀滞和血液外溢两种病理结局[1-2]。基于中医脏象理论，血液的推动、固摄与心脾功能密切相关，故有“心主血”“脾统血”的调控理论[3-4]。

在临床实际中，推动与固摄血液循行脉道之中是心与脾功能的协调[5]，气与血动态平衡，相互依赖，密切相关。因此，为验证这一理论在动物实验过程中的重现性[6]，并为临床应用提供指导，本研究选择了研究周期短、可以直观发现和测试血液动力学的斑马鱼为研究对象[7-8]，并在成功复制辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血的基础上，观察健脾益气摄血方及其拆方对斑马鱼血液流速的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

自然成对交配繁殖的黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼，共660尾，年龄为受精后3 d（72 h受精卵），饲养于28℃的养鱼用水中（水质：每1升反渗透水中加入200 mg速溶海盐，电导率为480～510 μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6 mg/L CaCO3）[9]。实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2012-0171。杭州环特生物科技股份有限公司的斑马鱼实验室已通过国际实验动物评估和认可管理委员会（AAALAC）完全认证，认证号：001458。

1.2 药物与试剂

实验药物与试剂如下，①颗粒配方：干预实验药物分别为A组（健脾颗粒配方）、B组（健脾益气颗粒配方）、C组（健脾益气补血颗粒配方）、D组（健脾益气补血摄血颗粒配方）。为排除人为因素影响实验结果，本研究采用了盲法设计，将课题组主要人员依据实验需求拟定的中药处方直接交付北京康仁堂制药有限公司生产，所有药物均按照颗粒剂工艺水提处理，并以A～D编号包装后转交实验人员，研究人員在严格盲态情况下实验并进行数据统计，并将统计结果转交课题负责人与药物制备人员，双方依据药物编号揭盲后确认。A组：实验药物为党参、白术、茯苓、炙甘草颗粒组成的健脾颗粒配方；B组：实验药物为党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪颗粒组成的健脾益气颗粒配方；C组：实验药物为党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、阿胶颗粒组成的健脾益气补血颗粒配方；D组：实验药物为党参、白术、茯苓、炙甘草、黄芪、阿胶、茜草颗粒组成的健脾益气补血摄血颗粒配方。实验开始前用斑马鱼饲养水配制成浓度为20 mg/mL的母液。②辛伐他汀：斑马鱼出血模型诱导剂，白色粉末，批号为404-520-2，购自日本TCI公司，用100% DMSO配制成浓度50 mmol/L的储备液，-20℃保存备用。③甲基纤维素（Methyl cellulose），白色纤维状，购自美国Sigma公司。

1.3 实验仪器

解剖显微镜（SZX7，OLYMPUS，Japan）；与显微镜相连的相机（TK-C1481EC）；心跳血流分析系统（Zebralab3.3（PB2084C）；精密电子天平（CP214，OHAUS，America）。

1.4 方法

全部实验由杭州环特生物科技股份有限公司在盲态下进行。利用随机数字表法将660尾3dpf黑色素等位基因突变型Albino品系斑马鱼分为正常对照组、模型对照组和实验药物A、B、C、D组。每种药物设100、250、500、750、1000 μg/mL五个不同浓度组，每组30尾。先以A、B、C、D组不同浓度药物处理斑马鱼4 h，再用50 μmol/L辛伐他汀处理30 min，用心跳血流分析系统采集各组20尾斑马鱼血流影像，分析血流量，计算改善率。血流量改善率（%）=[（实验药物组-模型对照组）/（正常对照组-模型对照组）]×100%。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对实验结果进行统计学分析，计量资料采用独立样本t检验或非参数检验，多组组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 斑马鱼出血模型判定

光学显微镜下观察心脏出血情况，当发现心脏部位有不同程度出血点或出血斑块时，即可判定斑马鱼心脏出血模型成功[9]。辛伐他汀诱导的斑马鱼心脏出血镜下图见图1。

2.2 对斑马鱼心脏出血模型血流量的影响

2.2.1 A组各浓度对斑马鱼心脏出血模型血流量的影响 与正常对照组比较，模型对照组血流速度明显降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，A组各浓度组对斑马鱼血流量无明显改善作用，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

2.2.2 B组各浓度对斑马鱼心脏出血模型血流量的改善作用 与正常对照组比较，模型对照组血流速度明显降低（P < 0.05）；与模型对照组比较，B组各浓度组对斑马鱼血流量无明显改善作用，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

2.2.3 C组各浓度对斑马鱼心脏出血模型血流量的改善作用 与模型对照组比较，C组的500、750、1000 μg/mL药物浓度组均能明显提高斑马鱼出血模型血流量改善率（P < 0.05），1000 μg/mL药物浓度组血流量改善效果最佳。见表3。endprint

2.2.4 D组各浓度对斑马鱼心脏出血模型血流量的改善作用 与模型对照组比较，D组的250、500、750、1000 μg/mL药物浓度组均能提高斑马鱼出血模型血流量改善率（P < 0.05），以1000 μg/mL药物浓度组改善效果最佳。见表4。

2.3 两种有效配方对斑马鱼心脏出血模型血流量影响比较

上述研究已经证实，C、D组药物能够明显改善斑马鱼心脏出血情况，为进一步探索两方存在的优势，本研究对健脾益气补血颗粒配方、健脾益气补血摄血颗粒配方中500、750、1000 μg/mL三个浓度对斑马鱼血流量的改善效果进行了比较，结果见表5。从表5可以看出，C、D两组组间500、750、1000 μg/mL三个药物浓度组比较，仅1000 μg/mL差异有统计学意义（P < 0.05）。提示高浓度的D组配方能提高辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流速度和血流量改善率效应。

3 讨论

血流量又称血流的容积速度，是指单位时间内流经血管某一截面的血量。血流量的大小与血管两端的压力差成正比，与血管对血流的阻力成反比。因心血管为一密闭的管道系统，流经动脉、毛细血管和静脉各段血管的总截面的血流量相等。

动脉血流速度随着心缩和心舒而波动，心室收缩时血流加快，舒张时血流变慢。例如，马的颈动脉血流速度，心脏收缩与心脏舒张时差异很大。这种波动幅度在小动脉管即逐渐变小，到了毛细血管，流速的波动即不明显，静脉的血流则始终表现均匀。因此，测定人类或大动物的血流量常采用静脉。而斑马鱼体积很小[10-12]，不易分离动静脉系统，测定静脉血流量非常困难。因此，在该项研究中，我们采用了心跳血流分析系统采集斑马鱼血流影像，分析血流量，并计算血流量改善率。

利用血流量测定技术可以明确判定实验动物整体血液流动状态，并能够判断实验动物的生理功能常态和病理现象，同时，能够为药理学研究提供疗效信息。通过分析本研究数据，可以看到：①与模型对照组比较，A、B组各药物浓度组对辛伐他汀诱导的斑马鱼心脏模型的血流量均无明显改善效果。其中，B组高浓度（1000 μg/mL）显示有提高血流量改善率的趋势。②与模型对照组比较，C、D组的500、750、1000 μg/mL药物浓度组均能明显提高斑马鱼出血模型血流量改善率（P < 0.05），以1000 μg/mL药物浓度组血流量改善效果最佳。③C、D组组间500、750、1000 μg/mL三个药物浓度组血流量改善率比较，仅1000 μg/mL具有统计学差异（P < 0.05），提示D组高浓度在改善辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流速度和血流量改善率优于C组。

气血都是人体生命活动的基本物质[13]，气血相辅相成、动态平衡是人体各种功能活动的根本保障[14]。气与血的关系可以概括为“气为血之帅，血为气之母”。前者讲的是气能生血[15]，也能够行血；后者讲的是血能载气，亦能化气[16-17]。研究发现，辛伐他汀诱导的斑马鱼出血模型的血流量降低、运动速度减缓等类似于中医气血两虚、气不摄血证候特点[18]。基于气血相关理论，对上述实验结果可能的解释如下：①健脾和健脾益气颗粒配方不能提高斑马鱼出血模型血流量改善率，可以用“气为血之帅”“有形之血不能速生”理论来解释，即单纯益气而非补血势必形成“气无所依”“气无载体”“气无所推”[19]的功能缺陷状态。②健脾益气补血与健脾益气补血摄血颗粒配方能够提高斑马鱼心脏出血模型血流改善率，可以用“血为气之母”以及“血即可载气运行”“气可推运血行”理论来解释[20]。③关于健脾益气补血摄血颗粒配方在改善辛伐他汀诱导斑马鱼心脏出血模型血流速度和血流量改善率优于健脾益气补血颗粒配方的解释，与茜草密切相关。茜草除具有止血功效外，还具有“祛瘀”功效。祛瘀可畅通脉道，促进血流，故而能提高辛伐他汀诱导斑马鱼出血模型的血流量。

健脾方和健脾益气方虽可补气，但无血药，不能体现“血能载气”的中医理论，因而气不能有效摄血。按照中医气血相关理论，补气即能生血，但因实验周期较短，有形之血不能速生；健脾益气补血方与健脾益气摄血方既能益气又能补血，体现了“气为血之帅，血为气之母”的气血相关理论，因而止血效果良好；健脾益气摄血方中茜草具有的“祛瘀、通经”功效能够疏通血管，畅调血液，不但可以加强健脾益气摄血方的摄血效果，也是发挥止血功效的载体；健脾益气补血方、健脾益气摄血方能够显著改善心脏出血斑马鱼血流量，进一步验证了气血相关理论和应用价值。

[参考文献]

[1] 张金生，张宝霞，朱慧芳，等.干细胞、微环境与活血化瘀[J].中国组织工程研究，2016，20（23）：3484-3490.

[2] 郝晶明，郭思兰.中药治疗小儿过敏性紫癜略述[J].中国中医药现代远程教育，2013，11（17）：117-118.

[3] 李天天，褚雨霆，杨璐，等.脾主统血理论的内涵与拓展[J].中医药信息，2015，32（6）：99-102.

[4] 潘光明，盛小刚，吴瑜，等.“心脾相關”理论源流探讨[J].中西医结合心脑血管病杂志，2011，9（6）：744-745.

[5] 沈真真，李运伦.“损其心者调其营卫”治则的探讨[J].中国中医药现代远程教育，2014，12（8）：11-13.

[6] 陈志炉，周郁鸿.中医药治疗免疫性血小板减少症临床研究概况[J].浙江中医杂志，2012，47（4）：304-305.

[7] 辛胜昌，赵艳秋，李松，等.斑马鱼模型在药物筛选中的应用[J].遗传，2012，34（9）：1144-1152.

[8] 王佑华，黎晌，杨彬睿，等.斑马鱼模型在中医药研究中的应用现状[J].中西医结合学报，2012，10（11）：1189-1197.

[9] Chu Y，Zhang L，Zhu X，et al. Investigation of hemostatic effect of Spleen-invigorating，Qi-replenishing and Blood-arresting Formula on simvastatin-induced zebrafish hemorrhage model [J]. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences，2016，3（4）：226-233.endprint

[10] 李辉辉，黄萍，董巍，等.斑马鱼研究走向生物医学[J].遗传，2013，35（4）：410-420.

[11] 钟敏.斑马鱼造血调控因子的研究进展[J].国际输血及血液学杂志，201l，34（1）：70-74.

[12] 李春梅.淫羊藿苷减轻阿伐他汀诱导的斑马鱼颅内出血[J].遵义医学院学报，2014，37（2）：181-182，187.

[13] 纪云西，黄贵华，蒋历，等.脾之“运与化”浅析[J].时珍国医国药，2013，24（2）：454-455.

[14] 周雪明，姜德友.国医大师张琪以气血为纲辨治疑难杂病[J].长春中医药大学学报，2015，31（4）：704-706.

[15] 陈素美.近二十年对中医脾生理功能的现代研究进展[J].中国中医基础医学杂志，2010，16（4）：348-351.

[16] 温洋洋，谢苗，郭选贤，等.对关幼波气血辨证的思考[J].光明中医，2015，30（10）：2093-2094.

[17] 褚雨霆，陈信义，李天天，等.运用脾统血理论指导免疫性血小板减少性紫癜临床治疗[J].中华中医药杂志，2016， 31（4）：1170-1172.

[18] 李天天，褚雨霆，刘庆，等.中医药治疗免疫性血小板减少性紫癜优势与问题分析[J].辽宁中医杂志，2015，42（1）：9-11.

[19] 紀云西，黄贵华，蒋历，等.脾之“运与化”浅析[J].时珍国医国药，2013，24（2）：454-455.

[20] Li T，He H，Hou L，et al. Regulation of non-classical immune parameters in immunethrombocytopenic purpura mice by a spleen-invigorating，qi-replenishing and blood-containing formula [J]. Journal of Traditional Chinese Medical Sciences，2015，2（2）：91-98.

（收稿日期：2017-09-05 本文编辑：张瑜杰）endprint