乳铁蛋白生物学功能及其检测方法研究进展

肖奕昕，赵善仓,董燕婕，李增梅，李晓雪，邓立刚，李霞，丁蕊艳，张树秋，李大鹏

（1.山东农业大学食品学院山东省高校食品加工技术与质量控制重点实验室，山东泰安271018；2.山东省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所/山东省食品质量与安全检测技术重点实验室，济南250100）

0 引言

乳铁蛋白(Lactoferrin，简称LF)是一种非血红素铁结合糖蛋白，其分子量约为80 ku[1]。1939年，Sorensen M等首次从牛乳中分离出来[2]；1960年，Johansson等首次从人乳中分离出来[3]；1961年，Blanche等从人乳中分离并命名为乳铁蛋白[4]。许多其他哺乳动物分泌物中也含有乳铁蛋白[5]。乳铁蛋白具有广谱抗菌性，调节体内铁平衡，抑制肿瘤细胞生长等[6]生物活性，在《食品营养强化剂使用标准》中，被列为一种新型营养强化剂。目前，乳铁蛋白主要检测方法有高效液相色谱法[7]、高效液相色谱串联质谱法[8]、聚丙烯酰胺凝胶电泳法[9]、分光光度法[10]、酶联免疫吸附法[11]等，但其检测方法依然是限制研究深入的主要技术瓶颈。本文综述了乳铁蛋白的功能及其检测方法的优缺点，并对该领域发展趋势予以展望。

1 乳铁蛋白的功能

乳铁蛋白是一种铁结合型糖蛋白，大约由700个氨基酸组成，其分子量为80 ku。人、鼠、牛、马、猪、山羊、绵羊、水牛和骆驼乳，这9种哺乳动物的乳铁蛋白具有高度的同源性，其中有两个显著的共同特征：(1)内部序列的两倍重叠；(2)高pH的碱性特征[12]。

乳铁蛋白仅包含一条多肽链，折叠成两个基本对称且高度同源的球状叶结构，呈现“二枚银杏叶型”结构。两个叶片的同源性可达33%～41%，一端是氨基末端(N-叶)，一端是羧基末端叶(C-叶)，1–332号氨基酸组成N-叶，344-703号氨基酸组成C-叶，在人类乳铁蛋白中，两个叶之间由铰链区相连接，铰链区为由乳铁蛋白的333号氨基酸到343号氨基酸所组成，以α-螺旋的形式存在，在乳铁蛋白的构想变化中起到纽带作用。每个叶包含一个铁结合位点，都能高亲和性地可逆的与铁结合。一个铁离子可与乳铁蛋白的4个氨基酸残基相连：2个酪氨酸、1个天冬氨酸、1个组氨酸相连。乳铁蛋白与铁离子结合之前，球状结构可随意伸展，铁离子结合到乳铁蛋白后会引起后者的构象变化，即使乳铁蛋白的分子结构更加紧密。铁进入每叶敞开的缝隙内部，然后此区域再相应闭合[13]。乳铁蛋白有α、β、γ三种异构形式，三者具有相同的理化性质及抗原性质[14]。许多研究表明，乳铁蛋白具有增强机体抗菌抗病毒能力[15]，体内铁的代谢[16]，调节机体免疫[17]，抗癌及抗氧化的功能[18]。

1.1 抗菌性

大量的体内、体外实验证明，乳铁蛋白具有广谱的抗菌性，抗革兰氏阴性菌、抗革兰氏阳性菌以及耐酸耐乙醇菌如结核杆菌等[13]。乳铁蛋白在酸性条件环境下通过胃蛋白酶的作用，释放出抗菌肽，牛乳铁蛋白肽B(Lacto ferricin B)f18-36和乳铁蛋白肽(Lacto ferram pin)f268-284，具有广谱抗菌性，对热和pH稳定，其抗菌的方式为杀菌。乳铁蛋白及其衍生物的抗菌特性主要是由于3个作用机制：(1)高度的铁结合能力，乳铁蛋白通过螯合铁离子以及静电结合铁离子与细菌竞争结合铁，从而抑制微生物的生长；(2)乳铁蛋白直接结合到微生物膜上，尤其是结合到革兰氏阴性菌的脂多糖上，造成外膜结构损伤和抑制病毒的复制；(3)阻止微生物附着在上皮细胞或肠上皮细胞上。同时，Suzanne[19]等发现，在有IgA和溶菌酶存在的情况下，乳铁蛋白的抗微生物感染能力会增强。

1.2 抗病毒性

乳铁蛋白能够抵抗许多病毒的感染，对感染人类和动物的RNA和DNA病毒具有广谱抗性，具有对呼吸道合胞病毒(RSV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(HCM V)、汉坦病毒抗性作用。乳铁蛋白浓度低于人乳乳铁蛋白浓度10倍时，能有效抑制人类呼吸道合胞病毒(RSV)，还能有效抑制无包膜的病毒如腺病毒和肠道病毒[20]。人类免疫缺陷病毒(HIV)仍然是一个重大的医学挑战，因为目前对其症状的治疗并不完全有效。体外研究表明，在人血浆和乳中，乳铁蛋白抑制病毒在宿主细胞中的复制从而抑制HIV的活性[21]。Wang[22]等发现乳铁蛋白能显著抑制人类免疫缺陷病毒1型逆转录酶(HIV-1RT)的活性，其半抑制浓度(IC 50)为6μmol/L。Andersen[23]等研究表明，不同乳铁蛋白和N端多肽(Lactoferricin)可以抑制抗巨细胞病毒(HCM V)早期和晚期抗原表达，同时抑制HCM V产生感染性病毒子代。Murphy[24]等在病毒感染前用400μg/m L乳铁蛋白在37℃处理细胞1小时，将与处理后的细胞共培养48小时，乳铁蛋白处理过的细胞中汉坦病毒的病毒灶仅有对照的15%，研究表明乳铁蛋白具有抑制汉坦病毒的作用。Shin[25]等人，通过给被流感病毒感染的小鼠个体口服0.06 g乳铁蛋白，发现缓解了其炎症症状。乳铁蛋白抗病毒作用的发生机制主要包括：(1)通过直接与病毒或病毒粒子结合，抑制病毒吸附和入侵靶细胞。(2)乳铁蛋白与靶细胞表面的病毒受体结合，阻断病毒和靶细胞结合，阻止病毒对宿主细胞的感染。(3)乳铁蛋白通过抑制部分病毒，如轮状病毒和脊髓灰质炎病毒感染细胞后的病毒复制，发挥抗病毒作用。(4)通过调节病毒等病原体引起的炎症反应和上调机体免疫系统，通过增强自然杀伤细胞和淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK cell)的细胞毒作用提高机体抗病毒反应，间接达到抗病毒目的。

1.3 参与体内铁代谢

乳铁蛋白在维持细胞的铁离子水平起到至关重要的作用。来自血清的运铁蛋白(T f)与乳铁蛋白（Lf）晶体结构、铁结合位点很相似。在生理pH下，乳铁蛋白与铁生成复合物的生成常数是运铁蛋白的260倍，而从LF-Fe复合物中去除铁的速度比T f-Fe慢100倍，在酸性条件下，T f几乎丧失了铁结合能力。Kaw akam i[26]等研究发现人、兔、猪等小肠黏膜细胞表面有特殊的乳铁蛋白受体(乳铁蛋白-R)，当乳铁蛋白到达肠道后，立即与该受体起反应，然后乳铁蛋白-R进入细胞内部，释放出Fe+3，这种特殊的乳铁蛋白受体可以提离铁的吸收率。贫血性疾病患者通常是体内缺少铁元素而导致贫血症状的产生，普通的口服补铁剂对粘膜会产生一定刺激，对肠胃系统存在较大副作用，且补铁效率较低，乳铁蛋白能够降低有效铁的使用量，可提高肠细胞对铁的生物可用性，同时也可以降低铁摄入过多的影响[27]。

1.4 调节机体免疫

乳铁蛋白是一种天然的有机体免疫调节剂，LF对先天及获得性免疫系统均有调节作用。LF存在于中性粒细胞的继发性颗粒中，是宿主防御第一道防线的主要组成部分。Wa kabayashi等[28]应用定量反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测小鼠肠道20个免疫相关基因，在乳铁蛋白浓度为2.5 g/kg时，对这些基因的表达产生特异性和非特异性的影响。LF的正电荷使其可与免疫系统中表面带负电荷的细胞结合，激活信号通路，引起细胞反应[29]。通过抑制促炎性细胞因子(如γ-干扰素，α-肿瘤坏死因子，白介素-1β、2、6)，发挥抗炎活性；促进自然杀伤细胞增生，增加血液中多形核细胞的数量，诱导吞噬作用；还可调节肠细胞及肠道相关淋巴组织(GALT)产生细胞因子，并促使细胞因子进入体循环作用于白细胞[17]。

1.5 抗癌作用

乳铁蛋白能促进正常细胞增殖，但对癌细胞却是起阻止而非刺激作用。研究表明，乳铁蛋白具有阻碍体外培养的癌细胞由G1向S期转化，达到抑制肿瘤细胞增殖的作用，主要是因为乳铁蛋白能诱导改变细胞周期中一些重要调节蛋白的表达水平或活性，其他一些体内研究认为，乳铁蛋白抗肿瘤作用也可能通过激活肿瘤细胞中FAS信号途径，或利用一些乳铁蛋白异构体所具有的DNA酶、RNA酶及ATP酶活性等，产生细胞毒性和诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。乳铁蛋白具有刺激抗肿瘤免疫的功能，可通过诱导细胞因子的产生、增加免疫细胞的数量以及增强免疫细胞的活性而提高宿主防御肿瘤的能力[30]。Jeffrey[31]等研究发现，人乳铁蛋白通过阻断细胞从G 0到G 1期的转化从而抑制肿瘤细胞增殖。另外乳铁蛋白可直接抑制内皮细胞的功能而发挥抗血管生成的作用[32]。

1.6 抗氧化作用

乳铁蛋白主要通过螯合Fe3+，减少羟自由基和DPPH自由基的产生，具有抗氧化作用[33]。另外乳铁蛋白可以抑制硫代巴比妥酸(TBA)和丙二醛(M DA)的生成[34]。非饱和乳铁蛋白可以隔离自由铁，保护糖蛋白不被氧化剂氧化。乳铁蛋白的抗氧化活性与磷脂体系、缓冲条件、金属离子的存在等具有一定关系。另外，乳铁蛋白具有的核糖核酸酶活性，能通过降解酵母tRNA抑制超氧离子形成，从而降低人体内自由基对动脉血管壁弹性蛋白的破坏，达到预防和治疗动脉粥样硬化和冠心病的目的。

2 乳铁蛋白检测方法

乳铁蛋白作为一种蛋白质，各种蛋白含量的常规分析方法都适用于其分析定量。目前来说，检测乳铁蛋白的分析方法主要分为理化分析法、免疫分析法、生物电化学法和表面等离子共振技术(SPR)等。

2.1 理化分析法

2.1.1 反相高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)的原理是在色谱柱中，各组分依照分配系数、吸附力大小等差异而被分离，并被检测器检出[35]。反相高效液相色谱(RP-HPLC)是HPLC中应用最为广泛的一种液相色谱法。RP-HPLC是由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系。

王德伟[7]等用pH 4.6的醋酸盐缓冲液溶解分离乳粉中乳铁蛋白，用C 18色谱柱快速分离，在10～500m g/L之间呈现良好的线性(R2=0.9999)，平均回收率为98.0%。夏明[35]等用无水乙醇使乳铁蛋白等沉淀，再用醋酸盐溶液除去酪蛋白，使用三氟乙酸及甲醇作为流动相，乳铁蛋白检测的线性范围是0.4～2m g/m L(R2=0.9980)，平均回收率95.4%。E.Tsakali[36]等使用乙腈水三氟乙酸作为流动相，乳铁蛋白检出线性范围为50～1 200μg/m L(R2=0.99)。

反相高效液相色谱法测定的结果准确，检测速度快易操作，实验再现性良好。但该方法对样品的纯度要求较高，当检测样品纯度较低时，由于乳铁蛋白与其他蛋白分子量相接近，使得在色谱柱上保留时间相近，各组分不易分离开，从而影响定量结果，因此适用于高纯度的样品测定。另外高效液相色谱所使用的流动相为乙腈，对环境产生一定的影响。样品前处理依然是限制液相色谱法检测乳铁蛋白的关键因素。利用液相色谱法检测目前常用的前处理方法是利用肝素亲和柱进行前处理的方法[37]，采用肝素亲和柱对样品进行前处理能够较好的分离和纯化生鲜牛乳中的乳铁蛋白，但是肝素亲和柱不适用于生鲜羊乳等其他特色乳中乳铁蛋白的分离纯化，仍含有其他种类的蛋白干扰检测。同时肝素亲和柱价格昂贵，且重复利用次数较少。

2.1.2 高效液相色谱串联质谱法

质谱仪是能够测量真空中离子的质核比(m/z)的一种仪器。根据质核比可以准确的确定待测物质的分子质量，从而确定其分子组成。蛋白质组中分析样品通常是某蛋白样品经胰蛋白酶或类似消化产生肽段的混合物，可以通过确定某蛋白的特异性肽段来定量该蛋白。

Zhang[8]等用碱性胰蛋白酶将牛乳铁蛋白酶切为肽段，确定乳铁蛋白的特异性肽段，用稳定同位素肽段作为内标，将蛋白质组学的酶解技术与高效液相色谱串联质谱相结合，检测各种乳与乳制品中乳铁蛋白含量。该方法最低定量限为1.5 m g/kg，回收率在93.2%～107.3%间。

高效液相色谱串联质谱法具有良好的回收率和重复性，准确度高，能够满足不同样品中的乳铁蛋白检测要求，可以同时对变性和非变性乳铁蛋白进行定量检测。前处理方法较为简便，基质效应会干扰质谱定量检测的准确度，可以通过使用内标的方法，降低基质效应对检测结果造成的影响。但是该方法所需要仪器较为昂贵，对特异性肽段的筛选也较为复杂，另外筛选出的特异性肽段，需要通过生物合成该特异性肽段作为标准品，合成过程较为复杂，操作难度大，需要操作人员具有较高的专业知识。

2.1.3 高效毛细管电泳分析法

高效毛细管电泳分析法(HPCE)[38]有很强大的分离能力，毛细管的分离柱效会随着分离样品分子的扩散系数减小而上升，蛋白质、肽类等生物大分子具有扩散系数小的特点，因此采用该法可以较好地分离及检测乳铁蛋白。陈永艳[39]等采用醋酸沉淀干扰蛋白质，离心后取上清液稀释十倍，以57 cm×50μm i.d.毛细管分离检测样品中乳铁蛋白，乳铁蛋白浓度在50-800 mg/L范围内与峰面积呈较为良好线性关系，检出限和定量限分别为15 m g/L和50 m g/L。许宁[40]采用67 cm×50μm i.d.毛细管，HPCE的毛细管区带电泳模式分离测定牛乳铁蛋白，乳铁蛋白进样浓度在100.0～600.0 mg/L范围内线性关系良好(r2=0.9995)，其最低检测限为25 mg/L。刘宇[41]等采用80cm×50μm i.d.未涂层石英毛细管柱，用各浓度为三羟甲基氨基甲烷200 mm o l/L，戊二胺60 mm o l/L，十六烷基溴化铵120 mm ol/L，聚乙二醇80 mm ol/L作动态涂层，分离检测乳铁蛋白，其线性范围为0.625～10 g/L，线性关系良好(r2=0.9996)。

高效毛细管电泳法测定乳铁蛋白含量具有前处理简单、分离效率高、分析速度快、操作简便、操作成本低等优点，但该方法仅适用于婴幼儿配方奶粉、保健食品中乳铁蛋白的测定，但该方法对于生乳中的乳铁蛋白测定效果不佳，其前处理无法除去生乳中其他杂质对于乳铁蛋白测定的干扰。

2.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳法

聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE电泳)是蛋白质分析中常用方法之一。SDS-PAGE是根据不同蛋白质分子所带电荷的差异以及分子质量大小不同，产生不同的迁移率，从而将蛋白质分离成若干条区带。该方法对于乳铁蛋白的分离效果较好。李珊珊[9]等采用凝胶电泳法检测定乳及乳制品中乳铁蛋白含量，结果表明用该分离方法检测的不同乳及乳制品中的乳铁蛋白含量的相对标准偏差小于10%，且测得的含量均高于其检出限和定量限。邢志恩[42]等通过SDS-PAGE电泳分离乳清蛋白，薄层扫描法定量不同来源乳中乳铁蛋白含量，乳铁蛋白加标回收率分别为104.53%、108.37%，同板精密度RSD值为3.10%和1.82%，在100～2 000μg/m L范围内呈线性关系，相关系数分别为0.9988和0.9990。

SDS-PAGE电泳法测定乳铁蛋白含量其实验结果准确度、重复性较好，不需复杂的前处理，灵敏度高，无需大量使用溶剂，但该方法每次检测的样品数量有限，配制凝胶、电泳以及染色脱色所需要的时间较长，前处理提纯乳铁蛋白较为粗糙，未除去的蛋白等会对结果造成一定影响。另外，配制凝胶时使用的聚丙烯酰胺等物质对人体产生有害影响，可作为初步定量乳及乳制品中乳铁蛋白的方法。

2.1.5 分光光度法

分光光度法(Spectrophotometry)是指通过检测特定波长或波长区间内被测物质的吸光度或发光强度，对该物质进行分析的方法[10]。

卢蓉蓉等[43]采用纯度为90%的乳铁蛋白溶液，在400-700 nm波长下进行扫描，发现乳铁蛋白在475 nm处有特征吸收峰，通过475nm处吸光度的不同来计算乳铁蛋白的含量。夏明[44]等通过对原分光光度法的改进，对婴幼儿奶粉中的乳铁蛋白进行检测，首先加入二价铁离子使乳铁蛋白中的铁达到饱和以获得稳定的铁含量，然后对蛋白反复醇沉和水溶以除去游离铁，再用原子吸收分光光度计测定铁含量，依据铁与蛋白含量的相互关系计算出乳铁蛋白含量。其加样回收率超过96%，检测范围为3.5～100m g/g。

分光光度法具有快速、简便、经济等优点，可以快速的测定出乳铁蛋白的含量，对仪器设备的要求不高，操作简便，适合于工厂中乳铁蛋白分离纯化过程中的快速检测，由于其检测的准确度不高，不适用于生鲜乳、婴儿配方乳粉等乳及乳制品中乳铁蛋白含量的精确测定。

2.2 免疫分析法

2.2.1 放射免疫扩散法

放射免疫扩散法(Radial Immunodiffusion)是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。

龚广宇[45]等将乳铁蛋白抗原混入琼脂糖中，倾入平板中，待琼脂糖凝结后打孔，接入乳铁蛋白样品，乳铁蛋白抗原呈放射形扩散，在以小孔为中心的环状区域形成抗原—抗体反应沉淀带，该沉淀带被R ID染色液染色，沉淀带环的直径与抗体乳铁蛋白的浓度成正比，通过标准曲线可以计算出乳铁蛋白含量，适用于婴儿配方奶粉的测定。

该方法虽操作较为简便，但是时间耗费较长，影响因素较多且复杂，检测范围有限，检测准确度不高，容易产生较大的误差，该方法的适用范围比较窄，仅适用于婴儿配方奶粉的测定，在实际操作中基本不采用该方法测定乳铁蛋白含量。

2.2.2 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(ELISA)是将抗原、抗体的特异性反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种新型、快速、准确的免疫学分析技术。

张英华[11]等应用酶联免疫法测定牛乳铁蛋白的含量，其检测的线性范围为0.8～100 ng/m L，最低检出量为0.5 ng/m L。卢蓉蓉等[43]应用酶联免疫法测定初乳中乳铁蛋白的含量，线性范围为3.1～200 ng/m L，最低检测限为1.5 ng/m L，回收率在91.82%～115.56%之间，变异系数在6.20%～9.18%之间。

酶联免疫法能够快速检测出乳铁蛋白含量，操作较为简便，而且能够同时对几十个甚至几百个试样进行检测，是一种较为理想的检测乳铁蛋白的方法，但是该方法在使用时，对待测样品应进行逐级稀释，较为繁琐，容易带来误差，另外所采用的试剂盒价钱较为昂贵。

2.2.3 胶体金标记法

胶体金是利用氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，在静电作用下形成稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记就是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。把抗乳铁蛋白抗体标记在胶体金颗粒表面，形成金探针，金探针与乳铁蛋白进行特异性结合，特异性结合产物可用分光光度计进行检测。

李岩[46]等采用胶体金标记法检测乳铁蛋白，得出最佳检测条件即检测波长为630 nm；金探针最佳浓度为1∶2；最佳pH值为7.4；稀释液中BSA的浓度为15 ug/m L；最佳检测温度为25℃；作用时间段为0-20 m in。结果表明：该法敏感性高，检测范围10-2 500 ng/m L，回收率95.89%，批内变异系数CV%=3.57%，批间CV%=4.74%。

胶体金法使用较少的标记物和样本，实验一步完成，很大程度上缩短分析时间，但实验容易受外界因素影响较大，会影响其灵敏度及检测限。

2.3 生物电化学法

循环伏安法(cyclic vo ltamm etry，CV)也称为线性变位循环伏安法，是一种最常用的动态电化学技术。通过记录电流随电位变化的曲线就可得到循环伏安图像。交流阻抗法(Electrochem ical Im pedance Spectroscopic)是一种以小振幅的正弦波电位(或电流)为信号扰动电解池，通过计算电极的电化学参数而进行检测的电化学测量方法。

曹杰[47]等通过循环伏安法和交流阻抗法对电极的每一步修饰进行了表征，其所构建的电化学检测技术的检测范围在10 pg/m L～1 g/m L之间，电极还原峰电流与乳铁蛋白浓度之间呈现良好的线性关系，检测限可低至3.3 pg/m L。

循环伏安法检测限低，检测灵敏，准确度高，但很容易受外界环境因素影响其实验结果，需要专业人士操作。

2.4 表面等离子共振技术

当入射光线以临界角入射到两种不同折射率的金属介质界面时，可以引起金属产生自由的电子共振，使得反射光在一定角度内减弱，其中能够使反射光在一定角度内完全小时的入射角我们称为SPR角。可以通过SPR角的变化，得到不同生物分子的特异性信号[48]。

Indyk[49]等通过表面等离子共振技术测定乳铁蛋白，其检测的浓度范围在0～1×10-3mg/m L，最低检测限达到0.0199m g/m L。

该方法样品消耗较少、检测准确度高、可实现自动分析，但是该方法在运用中其试验温度对测定结果影响较大，仪器设备造价也较为昂贵。

3 展望

乳铁蛋白具有多种生物学功能，是一种优质的天然蛋白质，乳铁蛋白的抗氧化能力机理还有待进一步研究。抗氧化对于人体具有重要的意义，目前人工合成的抗氧化剂虽然具有清除自由基等作用，但研究表明，人工合成的抗氧化剂对人体具有致癌、导致肝部疾病等副作用，需要寻找一种天然的抗氧化剂，因此对乳铁蛋白抗氧化功能的研究具有重要意义。另外乳铁蛋白对铁的转运效率极高，是一种优质的补铁剂，人工合成的无机补铁剂通常对肠道会造成刺激，且补铁效率低，目前，缺铁是引起贫血症状的主要原因之一，通过对乳铁蛋白补铁机理的特性研究，尝试研发出一种更为天然、安全、高效的补铁剂。乳铁蛋白具有的抗菌、抗病毒、调节机体免疫、抗癌等生物学功能的机理以及如何更好的利用乳铁蛋白的功能性质造福人类健康是未来的研究方向。

随着人们对乳铁蛋白的研究不断加深，乳铁蛋白的检测技术也会随着不断发展。其不同检测技术主要存在以下问题：从乳铁蛋白检测方法的适用范围来看，现有的检测方法通常只针对于基质较为简单的乳粉、乳铁蛋白纯化分离物、牛乳等，并没有一种方法可以很好地适用于大多数乳制品或其他特色生鲜乳如牦牛乳、骆驼乳、山羊乳等。从乳铁蛋白的前处理方法来看，对检测乳铁蛋白进行的前处理主要是去除酪蛋白的影响，但除酪蛋白外还存在其它蛋白或核酸等，会对检测结果产生影响。另外从其实验结果准确度及可操作性、普适性来看，现有的乳铁蛋白检测技术在结果准确度上还有待提高，液相色谱法、液相色谱串联质谱法、毛细管电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法等需要经过专业实验室以及专业人员操作，前处理复杂，需要的仪器设备价格昂贵；分光光度法其检测结果准确度有待提高；放射免疫扩散法、酶联免疫吸附法及生物电化学法等受环境等外界因素影响较大。如何检测多种乳产品的乳铁蛋白以及如何更快捷、简便的测定乳铁蛋白是今后乳铁蛋白检测技术的发展方向。

相信随着今后检测技术的不断发展，建立一种准确、快捷、经济、操作简便的乳及乳制品中乳铁蛋白检测方法，弥补我国乳铁蛋白检测国家标准的空白，推进对乳铁蛋白的更深入的研究，推动相关产业的健康发展。

参考文献：

[1]GONZALEZ-CHAVEZ SA,AREVALO-GALLEGOSS,RASCONCRUZ Q.Lactoferrin:structure,function and applications.Int JAntim icrob Agents.2009,33(4):301-308.

[2]SORENSEN M,SORENSEN SP L.The proteinsin whey.Compte-Rendu Des Travaux Du Laboratoire De Carlsberg Ser Chim,1939,23:55-99.

[3]JOHANSON B.Isolation of an iron-containing red protein from m ilk.1960,14(2):510-512.

[4]BLANC B,ISLIKER H.Isolation and characterization of the red siderophilic protein from maternalmilk:lactotransferrin.Bull Soc Chim Biol(Paris),1961,43(3):929.

[5]OLMO A D,CALZADA J,MANUEL N.Effect of lactoferrin and its derivativesagainst gram-positive bacteria in vitro and,combined w ith high pressure,in chicken breast fillets[J].M eat Science,2012,(90):71-76.

[6]曲练达,朴范泽,侯喜林,等.乳铁蛋白的国内外研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报,2005,17(6):50-54.

[7]王德伟,游景水,黄远英.反相高效液相色谱法快速测定乳铁蛋白含量[J].食品安全质量检测学报,2015,6(8):3088-3092.

[8]ZHANG J,LAIS,CAIZ,et al.Determination of bovine lactoferrin in dairy products by ultra-high-performance liquid chromatography–tandem massspectrometry based on tryptic signature peptides employing an isotope-labeled winged peptide as internal standard[J].Analytica Chimica Acta,2014(829):33-39.

[9]李珊珊,王加启,魏宏阳,等.凝胶成像系统SDS-PAGE法测定乳及乳制品中乳铁蛋白[J].农业工程学报,2008,(增刊2):283-288.

[10]刘晶,韩清波.紫外分光光度法鉴别复原奶和保鲜奶[J].中国乳品工业,2005,12:44-46.

[11]张华英,迟玉杰,懂平.酶联免疫法测定牛初乳中乳铁蛋白含量[J].中国乳品工业,1999,27(6):19-21.

[12]METZ-BOUTIGUE M H,JOLLES J,MAZURIER J,Human lactotransferrin:amino acid sequence and structural comparisons with other transferrins,Eur.J Biochem,1984,145(3):659-676.

[13]GONZALEZ-CHAVEZ SA,AREVALO-GALLEGOSS,RASCON-CRUZ Q.Lactoferrin:structure,function and applications.Int J Antimicrob Agents.2009,33(4):301-308.

[14]HWA NG P M.Three-dimensional solution structure of lactoferrin B,an antimicrobial peptide derived from bovine lactoferrin,Biochemistry,1998,37:4288-4298.

[15]安美忱,刘宁.牛乳铁蛋白素抗菌活性及抗菌活性位点[J].微生物学通报,2009,36(10):1526-1531.

[16]高树新,韩玉国,苏道,等.乳铁蛋白及其生理机能的研究进展[J].中国牛业科学,2008,34(2):48-51.

[17]程德勇,孙建华.乳铁蛋白对机体免疫功能的影响[J].临床儿科杂志,2009,27(2):88-90.

[18]陆苏丹.乳铁蛋白的功能与用途[J].乳业科学与技术,2000,23(4):25-26.

[19]SUZANNE JF,NEALED R,DAVID W H.Modulation of ceramide metabolism in T-leukemia cell lines potentiates apoptosis induced by the cationic antimicrobial peptide bovine lactoferricin[J].International Journal of Oncology,2008,32:537-544.

[20]SEGANTI L,DIBIASE A M,MARCGETTIM,PIETRANTON I A,TINARIA,SUPERTIF,Antiviral activity of lactoferrin towards naked viruses.Biometals,2004,17(3):295-299.

[21]VIANIR M,GUTTEBERG T J,LATHEY JL,SPECTOR SA.Lactoferrin inhibits HIV-1 replication in vitro and exhibits synergy when combined with zidovudine.Aids,1999,13(10):1773-1774.

[22]WA NG H,YE,X,NG T B.First demonstration of an inhibitory activity ofm ilk proteins against human immunodeficiency virus-1 reverse transcriptase and the effect of succinylation[J].Life Sciences,2000.67:2475-2752.

[23]ANDERSEN JH,OSBAKK SA,VORLAND L H,et al.Lactoferrin and cyclic lactoferricin inhibit the entry of human cytomegalovi-rusinto human fibroblasts[J].Antiviral Res,2001,51(2):141-149.

[24]MURPHY M E,KARIWA H,M IZUTANIT,et al.Characterization of in vitro and in vivo antiviral activity of lactoferrin and ribavirin upon hantavirus[J].J Vet Med Sci,2001,63(6):527-645.

[25]SHIN K,WA KABAYASHIH,YAMAUCHIK,et al.Effects of orally administered bovine lactoferrin and lactoperoxidase on influenza virus infection in mice.Journal of Medical Microbioligy,2005.54:717-723.

[26]KAWA KAM IH.Effect of iron-saturated lactoferrin on iron absorption.Agric Biol Chem,1988,52(2):903-908.

[27]倪丹,王彩云,云战友.乳铁蛋白的功能特性研究及应用进展[J].农产品加工,2011,6:87-90.

[28]WA KABAYASHIH,TAKAKURA N,YAMAUCHIK,et al.Modulation of immunity-related gene expression in small intestines of mice by oral ad ministration of lactoferrin.Clinical&Vaccine Immunology,2006,13(2):239.

[29]BAKER E N,BAKER H M.Lactoferrin Molecular structure,binding properties and dynamics of lactoferr in.Cellular&Molecular Life Sciences Cm ls,2005,62(22):2531-2539.

[30]GOLLH S,CROSSM L.Anticancer properties of bovinemilk,British Journal of Bovine Milk,2000,84:161-165.

[31]JEFFREY SW,GUOYAN L,ATUL V,et al.O ral lactoferrin results in Tc ell dependent tumor inhibition of head and neck squamous cell carcinoma in vivo[J].Clin Cancer Res,2007,13(5):1601-1610.

[32]SHIMAMURA M,YAMAMOTO Y,ASH INO H,et al.Bovine lactoferrin inhibits tumor-induced angiogenes is[J].Int Jcancer,2004,111(1):111-116.

[33]胡源媛,张守文.乳铁蛋白的功能特性及其国内外的应用情况[J].中国乳品工业,2005,33(12):31-34.

[34]凌雪萍,庞广昌.乳铁蛋白的最新研究进展[J].食品科学,2003,24(1):160-163.

[35]夏明,应铁进.高效液相色谱法检测乳制品中的乳铁蛋白含量[J].食品科学,2010,31(2):165-167.

[36]TSAKALIE,PETROTOSK,CHATZILAZAROU A,et al.Short communication:Determination of lactoferrin in Feta cheese whey with reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].Journal of Dairy Science,2014,97(8):4832-4837.

[37]章寅,高磊,郑隽,等.乳制品中乳铁蛋白的测定[J].现代农业科技,2013,16:292-291.

[38]SALVATORE ST,ANNA M D A,BRUNO M,et al.Purification ofa 76-kDa iron-binding protein from human seminal plasma by affinity chromatography specific for ribonuclease:structural and functional identity w ith m ilk lactoferrin[J].Biochimica et Biophysica Acta,1999,1430:104.

[39]陈永艳.高效毛细管电泳分析乳铁蛋白的方法研究[D].河北农业大学,2008:1-78.

[40]许宁.高效毛细管电泳法测定牛乳铁蛋白的含量[J].中国医院药学杂志,2005,25(4):296-297.

[41]刘宇,陈伟,史玉东,等.高效毛细管电泳法快速测定乳铁蛋白原料的纯度[J].中国乳品工业,2015,44(2):43-46.

[42]邢志恩,王军,戴蕴青,等.SDS-PAGE-薄层扫描联用法测定3种不同来源的乳铁蛋白[J].食品科学,2011,32(16):274-278.

[43]卢蓉蓉,许时婴,王璋.乳铁蛋白测定方法的比较.中国乳品工业,2002,150(5):123-125.

[44]夏明,应铁进.原子吸收分光光度法间接测定奶粉中的乳铁蛋白含量[J].药物分析杂志,2011,31(1):173-175.

[45]龚广予,巫庆华,吴正钧,等.一种检测乳铁蛋白的方法----放射免疫扩散法[J].中国乳品工业,2000,29(3):27-29.

[46]李岩.乳中乳铁蛋白检测方法的建立[D].河南农业大学,2008:1-66.

[47]曹杰.利用电化学技术研究乳铁蛋白的杀菌机理及其检测新方法的构建[D].上海大学,2014:1-61

[48]孟庆石,劳文燕,潘映红.表面等离子共振生物传感器技术及在生命研究中的应用[J].生命科学仪器,2009,7(1):10-13.

[49]INDYK H E,FILONZIE L.Determination of lactoferrin in bovine milk,Colostrum and infant formulas by optical biosensor analysis[J].International dairy journal,2005,15:429-438.