5-氮杂胞苷对低温胁迫下黄瓜幼苗光合作用的影响

邢潇晨，索琳格，肖春燕，刘苗苗，刘慧英，崔金霞

(石河子大学农学院园艺系，特色果蔬栽培生理与种植资源利用兵团重点实验室， 新疆 石河子 832003)

DNA甲基化(DNA methylation)是一种常见和重要的表观遗传修饰形式，是在DNA甲基转移酶(DNA methyl transferase, DNMT)的作用下，将S-腺苷-甲硫氨酸(S-daomet, SAM)的甲基基团转移到胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)上，最常见的是转移到C，形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)，完成DNA的共价修饰，从而影响到DNA和蛋白质的相互作用，抑制基因的表达[1-2]。DNA甲基化不仅参与植物生长发育调控[3-4]，近期研究表明外界不良环境条件如干旱、盐害、冷害等非生物胁迫能够诱导植物基因组DNA甲基化水平和状态(半甲基化、全甲基化、去甲基化)发生变化，从而影响到植物基因表达和转座子的转座活性，进而对其生物遗传信息进行调节，为植物适应不良环境创造有利的条件，而逆境胁迫结束后，DNA甲基化又恢复到胁迫之前的水平，避免基因不必要的活跃表达与能量浪费[5]。

植物体内基因组DNA甲基化水平的变化与不同温度环境胁迫有关，低温及高盐胁迫诱导抗逆相关基因编码区去甲基化，增加基因的表达量以应对环境胁迫[6]；低温胁迫条件下，许多种植物都会发生基因组DNA甲基化水平的降低。如在低温胁迫条件下，玉米幼苗根部组织的基因组DNA甲基化水平降低了至少10%[7]。5℃冷处理水稻48 h后，基因组甲基化模式和水平发生明显改变[8]。低温胁迫下甲基化水平降低之后，植物基因组转座子活性被激活，例如金鱼草的Tam3转座子，15℃的低温胁迫诱导了Tam3序列的甲基化水平特异性变化，即发生了去甲基化，并激活了转座子的转录，25℃时甲基化受到强烈抑制[9]。低温胁迫往往通过诱导抗逆基因甲基化水平的变化，来改变转录组的转录表达，以提高在低温胁迫下的抵抗力和适应力，Hashida等研究表明低温胁迫条件下，转座酶在DNA复制和细胞分裂结束后立即结合于Tam3转座子上，导致了DNA甲基化水平降低[10]。Shan等利用MSAP法研究发现低温处理后，玉米幼苗全基因组DNA甲基化多态性占总条带的32.6%～34.8%，大多数片段发生了去甲基化现象，对特异性片段回收测序，进行BLAST比对，结果表明这些片段的同源染色体涉及到许多过程，包括激素调节，低温反应，光合作用和转座子激活等[11]。

5-氮杂胞苷(5-azaC)是目前植物上研究和应用最多的DNA甲基化抑制剂之一，可以降低基因组甲基化水平[12]，在植物的表型性状[13-14]，植物春化作用和开花[15-17]等方面都有研究。但对于5-azaC降低基因组甲基化水平在植物抗逆机理中的作用相关研究较少，有研究表明合适浓度的5-azaC处理可以减缓白菜幼苗在高温胁迫下的生长量、POD活性和蛋白质含量的降低幅度，同时降低MDA含量和细胞膜透性[18]。

黄瓜是一种喜温作物，其所有组织对低温都敏感[19]。10℃～12℃以下低温即能引起黄瓜生理活动的失调，呈现生理障碍[20]，黄瓜光合器官的受损也表现的较为明显[21]。低温能降低植物光合效率、改变光合色素组成、抑制叶绿体发育等，因此本试验以黄瓜为材料，喷施不同浓度5-azaC，对低温胁迫下黄瓜幼苗叶片气体交换参数、光化学效率、光能分配、相对电导率等进行了一些探索，以期为降低基因组DNA甲基化水平在植物耐冷性中的作用机理提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料及其处理

以“津研四号”黄瓜品种为试材，5-azaC药剂购自美国Sigma公司。试验于2013年在石河子大学农学院试验站温室中进行。

黄瓜种子经55℃温汤浸种处理后，于28℃条件下在人工智能光照培养箱中进行避光培养催芽，选择刚刚萌动、芽势一致的种子播于72孔穴盘内，子叶展平时分苗于120 cm×110 cm的育苗钵中，基质为草炭∶蛭石=2∶1(v∶v)，间隔5 d浇灌一次霍格兰营养液。幼苗长出两片真叶时，选取大小、形态一致且无病虫害的幼苗进行预处理。

5-azaC浓度设：CK、100、250、500、800、1 000、2 000 μmol·L-1和5 000 μmol·L-1。处理期间，每天早上10∶00，整株幼苗均匀喷施5-azaC，同时CK喷洒蒸馏水，每天一次，连续喷3 d，然后置于光照培养箱中进行低温处理，昼夜温度设定为10℃ /6℃，光照时间为12 h，光照度为300 μmol·m-2·s-1。分别于低温处理0 h(即低温处理前)、低温处理24 h和低温处理48 h三个时间段进行取样，每个处理重复3次。

1.2 细胞膜透性的测定

细胞膜透性采用相对电导法[22]。

1.3 气体交换参数的测定

用英国PP-Systems公司生产的CIRAS-2型光合仪在光照培养箱内测定300 μmol·m-2·s-1下黄瓜幼苗最佳功能叶片(上数第2叶)的光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)和胞间CO2浓度(Ci)。

1.4 叶绿素荧光猝灭

在低温0 h、24 h和48 h，黄瓜幼苗在光照培养箱内暗适应25 min，用英国Hansatech公司生产的FMS-2脉冲调制式叶绿素荧光仪测定叶绿素荧光参数。根据Demming-Adams和Adams[23]及FMS-2型叶绿素荧光仪使用手册进行计算，公式如下：

暗适应下PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)=(Fm-Fo)/Fm；

PSⅡ实际光化学效率(ΦPSⅡ)=(Fm′-Fs)/Fm′；

PSⅡ天线转化效率Fv′/Fm′=(Fm′-Fo′)/Fm′；

光化学猝灭系数qP=(Fm′-Fs)/(Fm′-Fo′)；

非光化学猝灭系数NPQ=(Fm-Fm′)/Fm′；

电子传递速率ETR=ΦPSⅡ×PFD×0.84×0.5，其中PFD是被吸收的光通量密度(μmol·m-2·s-1)，0.5代表光能在两个光系统间的分配系数，0.84指入射到叶片表面的光能平均有84%被叶片吸收[24]。

利用荧光参数计算PSⅡ吸收光能分配和光系统激发能分配的情况[25-26]：PSⅡ吸收光能用于光化学反应的相对份额(P)=Fv′/Fm′×qP×100%；用于天线热耗散的相对份额(D)=(1-Fv′/Fm′)×100%；用于反应中心耗散的相对份额(Ex)=Fv′/Fm′×(1-qP)×100%。

光系统Ⅰ(PSⅠ)与PSⅡ间激发能分配不平衡性(β/α-1)=(1-f)/f(其中f为PSⅡ反应中心开放程度，f=(Fm-Fs)/(Fm-Fo)；α、β分别为PSⅠ和PSⅡ的激发能分配系数)。

1.5 数据统计分析

采用Excel软件进行数据的统计分析，计算平均值、标准差；用SPSS 17.0软件对数据进行单因素方差分析，并用 Duncan’s检验法对显著性差异(P<0.05)进行比较；用OriginLab 7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 低温下不同浓度5-azaC处理对黄瓜幼苗细胞膜透性的影响

由图1可知，低温0 h(低温处理前)，不同浓度5-azaC处理的黄瓜幼苗叶片相对电导率比较一致，随着低温处理时间的逐渐延长，各处理相对电导率的值也逐渐增大。低温胁迫24 h和48 h，与各自对照相比，100～800 μmol·L-1的5-azaC处理降低了相对电导率值，其中喷施浓度为500 μmol·L-1的5-azaC处理的相对电导率降低幅度最大，比各自的对照分别减小了24.94%和27.98%。说明喷施合适浓度的5-azaC处理可以缓解低温弱光对黄瓜幼苗细胞质膜结构和功能造成的影响。

2.2 低温下不同浓度5-azaC处理对黄瓜幼苗光合作用的影响

从图2(A，B，C，D)可以看出，与低温0 h相比，低温24 h和48 h，不同浓度5-azaC处理的Pn、Gs和Tr呈现下降的趋势，Ci呈现上升的趋势；在低温0 h、24 h和48 h，不同浓度的5-azaC处理表现出明显的浓度效应，从100～500 μmol·L-1处理的Pn、Gs和Tr值逐渐上升，Ci值逐渐下降，500～5 000 μmol·L-1的5-azaC处理Pn、Gs和Tr值逐渐下降，Ci值逐渐上升，其中500 μmol·L-1的5-azaC处理是拐点，表明低浓度的5-azaC处理在低温处理前和低温下可以增强黄瓜的光合作用，而高浓度5-azaC处理则表现出抑制作用。

图1低温下不同温度5-azaC对黄瓜幼苗叶片相对电导率的影响

Fig.1 Effects of 5-azaC concentrations on relative electrical conductivity of cucumber seedling under low temperature

2.3 低温下不同浓度5-azaC处理对黄瓜幼苗叶绿素荧光参数的影响

由图3(A)可知，进行低温处理后，随着低温时间的增长，黄瓜幼苗叶片的Fv′/Fm′值逐渐降低，低温24 h和48 h的对照与0 h的CK相比，分别降低了3.46%和5.26%，这表明低温处理促使PSⅡ天线激发能的捕获效率降低。喷施5-azaC可以减缓黄瓜幼苗叶片的Fv′/Fm′值降低的速度。低温处理24 h，500～800 μmol·L-1的5-azaC处理与其对照相比Fv′/Fm′值分别提高了3.94%和3.67%。低温处理48 h，500～800 μmol·L-1的处理Fv′/Fm′值比CK分别提高了2.79%和2.80%。Fv/Fm的下降，表明PSⅡ受到损伤。

由图3(B)可知，低温0 h，与CK相比，经5-azaC处理的幼苗Fv/Fm值升高，但都在0.80～0.85之间，表明此时黄瓜叶片的PSⅡ未受到任何损伤，且经5-azaC处理，能提高PSⅡ反应中心内能转化效率。与低温处理0 h相比，低温24 h和48 h黄瓜幼苗叶片的Fv/Fm值都降低，表明此时黄瓜叶片已经受到光抑制。与各自对照相比，在100～800 μmol·L-1的浓度范围内，随着浓度的增加，Fv/Fm值也逐渐提高，经500 μmol·L-1的5-azaC处理的叶片Fv/Fm值提高最明显，分别提高了0.98%和1.11%。

图2 低温下不同浓度5-azaC对黄瓜幼苗叶片光合作用的影响

图3低温下不同浓度的5-azaC对黄瓜幼苗叶片叶绿素荧光参数的影响

Fig.3 Effects of 5-azaC concentrations on chlorophyll fluorescence parameters of cucumber seedlings under low temperature

由图3(C)可知，与低温0 h相比，低温24 h和48 h，ΦPSII逐渐下降。但经5-azaC处理可提高低温胁迫下黄瓜幼苗叶片的ΦPSII值，且在100～1 000 μmol·L-1浓度范围内随着浓度的增加而提高，500～800 μmol·L-1的处理ΦPSII值提高最明显。1 000 μmol·L-1之后的处理使ΦPSII值急剧下降，说明高浓度的5-azaC处理促使PSⅡ光化学活性降低。

由图3(D)可知，与低温0 h相比，低温24 h和48 h黄瓜幼苗ΦPSII和ETR都显著降低，说明黄瓜幼苗经低温处理，PSⅡ光化学活性降低，光合电子传递受到限制。低温下不同浓度的5-azaC引起的光合电子传递速率(ETR)的变化趋势与ΦPSII相似。

2.4 低温下不同浓度5-azaC处理对黄瓜幼苗叶绿素荧光猝灭的影响

叶绿素荧光猝灭包括光化学猝灭(qP)和非光化学猝灭(NPQ)。光化学猝灭系数(qP)表示总PSⅡ反应中心中开放的反应中心所占比例的指标，在一定程度上反映了植物光合活性的高低。由图4(A)可知，与低温0 h相比，低温处理24 h和48 h的qP值持续下降，表明叶片捕获的激发能中用于推动光化学反应的部分所占比例下降，植物光合活性降低。低温0 h、低温24 h和48 h，不同浓度5-azaC处理的黄瓜幼苗qP值呈现先升高后降低的趋势，500～800 μmol·L-15-azaC处理表现最为明显，qP值达到峰值。这表明100～800 μmol·L-15-azaC 处理能够减缓低温下黄瓜叶片光合活性降低的速度，提高叶片捕获的激发能中用于推动光化学反应的部分所占比例。

NPQ反映了植物耗散过剩光能为热的能力，常用于衡量过剩激发能的耗散情况，NPQ逐渐增大，说明叶片为保护光合机构免遭破坏迅速启动热耗散，以耗散过剩能量。由图4(B)可以看出，与低温0 h对照相比，低温处理24 h和48 h黄瓜幼苗叶片NPQ值急剧增大，分别增大了153.83%和250.48%。低温24 h和48 h，与各自的对照相比，不同浓度5-azaC处理使NPQ值呈现先减小后增大的趋势。最明显的是低温24 h，500 μmol·L-1的处理急剧减少，与其对照相比，减少了46.10%。

Y(NO)是PSⅡ处于非调节性能量耗散的量子产量，若Y(NO)较高，表明光化学能量转换和保护性的调节机制(如热耗散)不足以将植物吸收的光能完全消耗掉，即入射光强超过了植物能接受的程度，因此Y(NO)可以作为光损伤的重要指标。由图4(C)可知，与低温0 h相比，随着低温时间的延长，Y(NO)值逐渐升高，表明低温时间的长短与黄瓜叶片的光损伤程度成正比。喷施一定浓度的5-azaC可减缓低温造成的黄瓜叶片光损伤程度。其中500～800 μmol·L-1的处理效果最明显。

图4低温下不同浓度5-azaC对黄瓜 幼苗叶片qP、NPQ和Y(NO)的影响

Fig.4 Effects of 5-azaC concentrations onqP,NPQandY(NO) of cucumber seedlings under low temperature

2.5 低温下不同浓度5-azaC处理对黄瓜幼苗光化学速率、天线热耗散速率及其分配比例影响

利用荧光参数可将植物叶片吸收的光能分为三个部分：天线上耗散的能量D、反应中心由非光化学反应耗散的能量Ex、用于光化学反应的部分P。通过计算它们占总吸收光能的百分比，可以了解植物的光能利用能力。

由图5(A，B，C)可知，与低温0 h相比，低温处理24 h和49 h，黄瓜幼苗叶片反应中心用于光化学反应的能量(P)逐渐降低，用于反应中心由非光化学反应耗散的能量(Ex)和天线上耗散的能量(D)逐渐增高。其中喷施500～800 μmol·L-1的5-azaC处理与对照相比P值逐渐升高。与此相对应，说明喷施5-azaC可以提高黄瓜幼苗叶片反应中心用于光化学反应的能量所占的比例。

PSⅠ和PSⅡ间激发能分配不平衡性可用β/α-1表示。由图5(D)可知，黄瓜幼苗叶片PSⅠ和PSⅡ间激发能分配偏离平衡程度与低温处理时间成正比，即随低温处理时间增加，黄瓜幼苗叶片偏离平衡的程度越严重。从不同浓度处理下叶片PSⅠ和PSⅡ间激发能分配平衡偏离系数(β/α-1)来看，500～800 μmol·L-1的5-azaC处理促使黄瓜幼苗叶片PSⅠ和PSⅡ间激发能分配偏离平衡程度较小，有利于两个光系统之间彼此传递的协调。

图5低温下不同浓度的5-azaC对黄瓜幼苗叶片光能分配和光系统激发能分配的影响

Fig.5 Effects of 5-azaC concentrations on the allocation of absorbed light of cucumber seedlings under low temperature

3 讨 论

植物的低温伤害始于细胞膜系统。细胞膜透性增大将会导致一系列代谢变化，最终造成细胞死亡[27]。本研究结果表明，随着低温时间的延长，与低温0 h相比，低温24 h和48 h，黄瓜幼苗叶片相对电导率值明显增加，说明已经对黄瓜幼苗膜系统造成了伤害，而500 μmol·L-1的5-azaC处理显著降低了低温对细胞膜的伤害，因而起到了抗冷的作用。这可能与500 μmol·L-1的5-azaC处理能够显著提高黄瓜叶片SOD、CAT、APX和GR抗氧化酶活性清除过多活性氧有关[28]。

低温能够直接影响植物光合器官的结构和活性，也可以通过对植物生理过程作用间接影响植物光合作用。低温导致植物光合作用下降的因素有气孔因素也有非气孔因素。Farquhar等[29]认为植物叶片净光合速率下降的主要原因有两方面：(1) 由于气孔导度下降，CO2的供应受到阻滞；(2) 植物叶片叶肉细胞光合性能下降，导致叶肉细胞同化CO2的能力下降，这样就会导致胞间CO2浓度升高。本试验结果表明，低温下，黄瓜幼苗叶片的Pn、ΦPSⅡ和Fv/Fm明显降低，胞间CO2浓度(Ci)显著升高(P<0.05)，由此可以看出Pn值下降是由非气孔因素限制。同时也说明叶片的光能转换效率降低，增加了过剩激发能，从而引起光抑制，叶片的光合机构受到伤害。这与前人的研究结果[30]相一致。本试验中，低温下喷施500～800 μmol·L-1的5-azaC预处理的Pn、ΦPSⅡ和Fv/Fm的增幅较大，说明适宜浓度的5-azaC能够通过调节低温下黄瓜幼苗叶片的光合功能来减轻低温对植株的伤害。

叶绿体吸收的光能除用于光合作用外，还有一部分在形成同化力之前以热耗散的形式流失和以荧光的形式重新发射出来。低温下，光化学猝灭系数(qP)呈降低趋势。但喷施500～800 μmol·L-1的5-azaC处理可以提高低温下黄瓜幼苗叶片的qP值，即提高了叶片捕获的激发能中用于推动光化学反应的部分所占比例。而非光化学猝灭系数(NPQ)呈现升高的趋势，说明黄瓜叶片为保护光合机构免遭破坏迅速启动热耗散，以耗散过剩能量，是植物适应低温的体现。Y(NO)的趋势与NPQ一致，但喷施500～800 μmol·L-1的5-azaC可减缓NPQ下降程度，减缓低温对黄瓜幼苗叶片造成的光损伤。

本试验中通过测算叶片的光化学速率、天线耗散速率及其占总吸收光能的比例，了解黄瓜叶片在低温下的光能利用能力。结果表明，低温条件下，吸收光强分配于光化学反应的部分降低，而用于天线热耗散比例和反应中心由非光化学反应耗散的能量逐渐升高，且主要以光化学反应的部分为主要光能分配途径。经5-azaC处理的黄瓜幼苗叶片与低温对照相比，吸收光强分配于光化学反应的部分先减少(低温24 h)后增加(低温48 h)，而天线热耗散比例先增加后减少，这种变化可以认为低温处理24 h，植物对逆境的一种适应能力，激发能天线热耗散比例增加，低温处理48 h，反应中心用于非光化学反应耗散的能量开始升高，这部分能量由于反应中心的关闭不能用于光化学反应，只能作为过剩光能由反应中心以非光学反应的形式加以耗散，在耗散过程中，能量可能会传递至O2，形成破坏性极大的单线态1O2[31]，并形成各种活性氧分子，对叶绿体和细胞造成氧化损伤。从黄瓜幼苗叶片PSⅠ和PSⅡ间激发能分配平衡偏离系数(β/α-1)来看，随着低温处理时间积累，(β/α-1)逐渐增大，说明植物叶片的两个光系统间激发能分配已严重失衡。经500～1 000 μmol·L-1的5-azaC处理与低温对照相比偏离平衡的程度较小，说明适宜的浓度可以在一定程度上减缓两个光系统间激发能失衡程度。

综上所述，500～800 μmol·L-1的5-azaC处理可明显缓解低温对黄瓜幼苗叶片细胞膜的伤害，并且在一定程度上抑制了膜脂过氧化作用，降低叶片细胞伤害率；500～800 μmol·L-1的5-azaC处理可促使黄瓜幼苗在低温下的净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)、蒸腾速率(Tr)的升高，胞间CO2浓度(Ci)的降低；同时也促进PSⅡ的最大光化学效率(Fv/Fm)、实际光化学效率(ΦPSⅡ)、光合电子传递效率(ETR)和光化学猝灭系数(qP)的升高，非光化学猝灭系数(NPQ)和叶片光化学猝灭参数[Y(NO)]的降低。上述结果表明，低温下，500～800 μmol·L-1的5-azaC处理有助于维持黄瓜叶片中较高的光系统活性和碳同化能力，从而保护光合系统，降低低温胁迫对植物的损伤，提高黄瓜幼苗的耐冷性。但5-azaC处理对黄瓜幼苗低温下光合特性的影响机理及对以后黄瓜植株生长、产量及品质等的影响，还有待进一步研究。

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