血红素氧合酶-1抗动脉粥样硬化作用与机制的研究进展

魏刚 综述 黄维义 审校

(西南医科大学附属医院心内科，四川 泸州 646000)

以动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)为病理基础介导的心脑血管疾病是世界范围内的首要死因，目前已有研究证实，AS实质上是一种以脂质和炎细胞浸润为特征的慢性进展性血管炎症疾病，已知AS高危致病因素如吸烟、高血压、糖耐量及脂代谢异常均可诱发机体内炎症及氧化应激，而炎症和氧化应激已被公认为是致AS的两个关键环节，同时也是促使斑块破裂、诱发不良心血管事件的罪魁祸首[1-2]。已知血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是由Nrf-2调节的基因转录产物之一，是细胞内极重要的可诱导性抗氧化酶，主要通过催化游离血红素降解最终生成胆红素、一氧化碳(CO)和Fe2+等产物来发挥抗氧化应激、抑制炎症、调控细胞增殖与凋亡以及调节免疫等多重作用，从而发挥包括抗AS在内的心血管系统保护作用。对HO-1抗AS作用与机制的研究，包括冠心病在内的多种心血管疾病的防治开拓新的思路。

1 氧化应激和炎症在致AS中的作用及机制

氧化应激是指各种有害因素促使体内活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生与消除失衡，致使ROS在体内大量蓄积并导致相应组织损伤的病理过程。氧化应激与AS发生、发展及斑块破裂所致的急性冠脉综合征均密切相关[3]。研究表明，氧化应激首先导致内皮细胞损伤并由此启动AS病理过程。血浆中的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)易于透过损伤的血管内皮大量沉积于血管壁并在此被ROS氧化修饰形成氧化修饰型低密度脂蛋白(ox-LDL)，后者有很强的致氧化应激和致炎症作用，在加重内皮细胞损伤的同时也促使其活化并表达C反应蛋白、白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子-α 、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等多种炎症因子；ROS还可刺激亲环素A表达，进而介导细胞外调节蛋白激酶12活化并激活信号分子p70S6K，催化40S核糖体蛋白S6磷酸化而引起细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子、内皮细胞黏附分子等表达，这些黏附分子与MCP-1等炎症因子能募集循环中的单核细胞迁移、浸润于内皮下并活化为有强烈致炎作用的经典活化型 (M1)巨噬细胞，后者一方面可通过清道夫受体A无限制大量吞噬ox-LDL变成泡沫细胞，促发AS并增加斑块内的脂质成分；另一方面则是大量合成和分泌炎性因子(IL-1、肿瘤坏死因子-α等)、ROS、活性氮等，进一步促进和放大炎症反应、损伤血管内皮并诱导血管平滑肌细胞(SMC)增殖和迁移，这些都是AS的重要病理特征；此外，激活的巨噬细胞还能分泌基质金属硫蛋白酶，可降解细胞外基质，减少斑块内胶原及弹性蛋白含量，从而促发斑块破裂与局部血栓形成，引发不良心血管事件。总之，氧化应激和炎症在AS发生、发展过程中始终是相辅相成，互相加强，彼此形成恶性循环[4]。

2 HO-1的概况

Tenhunen 等在20世纪60年代首次发现并报道了HO系统，并明确其主要作用是充当降解清除游离血红素的起始酶与限速酶。随着研究的深入，目前发现HO主要有三种同工酶：HO-1、HO-2及HO-3，它们分别由不同的基因编码,在基本结构、表达调节和组织分布中均有明显差异。其中HO-2为结构型蛋白，几乎存在于所有组织器官中，以睾丸和脑组织分布较多，主要发挥正常的生理调节作用；HO-3也是结构型蛋白且与HO-2具有约90%的相同氨基酸序列，但其生理效能与HO-2相比却极其低下，目前尚不能明确其生理作用，可能与血红素的识别或绑定有关[5-6]；HO-1为诱导型，因其相对分子质量为32 000，故又被称为热休克蛋白32，主要分布于心脏、肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等器官的细胞微粒体内，生理状态下的HO-1表达通常处于相对稳定的较低水平，在众多致细胞损伤的应激因素(如炎症、缺血、缺氧、高温、放射线、内毒素等)刺激下，通过活化转录因子AP-1及Nrf-2而在转录水平上调HO-1基因表达，可见，HO-1主要是在各种病理性应激状态下发挥重要的抗氧化应激与抗炎症损伤等组织细胞保护作用，而保护作用大小则取决于其酶的活性[7-8]。

3 HO-1拮抗氧化应激与炎症损伤的作用及机制

已知血红素系血红蛋白分解后残留的非蛋白质的铁卟啉组分，细胞内的游离血红素本身就是一种具有显著细胞毒性的强氧化剂，HO-1对游离血红素的高效降解便是其抗氧化应激作用的机制之一，但更为重要的是HO-1催化血红素降解还能生成胆红素、CO和Fe2+等重要产物，这些产物可分别通过不同途径发挥强大的抗氧化应激与炎症损伤作用。

3.1 胆红素在HO-1抗氧化应激与抗炎症损伤中的作用

胆红素是HO-1降解血红素生成的胆绿素再经胆绿素还原酶催化而成的终产物，在相当长一段时间内胆红素都被认为是一种有毒的废弃产物，其血液浓度的高低被认为是一种能反映肝脏功能的指标[9],但近年发现，胆红素在适当浓度范围内的合理升高对机体有益，进一步研究显示，胆红素其实是一种比维生素E及维生素C都更强的内源性广谱抗氧化剂[10]，这与其特殊的分子结构有关，已知胆红素分子内含有一个延伸的共轭双键体系和活性氢原子，因而易与超氧阴离子等多种形式的自由基结合并对后者予以清除，能阻止各种脂质过氧化反应，尤其可有效抑制LDL被氧化修饰成ox-LDL，而后者正是AS的关键致病分子[11]，胆红素还能抑制ox-LDL引起的补体活化和炎症反应带来的损伤，起到阻止或减慢AS进程、保持斑块稳定等作用[12]。此外，胆红素的亲脂性也使它易与细胞膜交联而保护后者免遭脂质过氧化损伤，从而提供了高效的包括血管内皮在内的细胞保护作用[13]。Ollinger 等[14]给载脂蛋白E缺乏小鼠应用外源性胆红素，证实胆红素不仅能抑制炎症，还能阻止血管SMC周期的进展从而抑制SMC增殖，显示其具有明显的抗AS效果。

3.2 CO在HO-1抗氧化应激与抗炎症损伤中的作用

HO-1催化游离血红素降解是细胞内源性CO的主要来源。CO是一种无色、无味、无刺激性的双原子气态物质，生理条件下当外源性CO浓度达到较高水平时，能够经呼吸系统与血红蛋白结合生成碳氧血红蛋白而丧失携氧功能，故可致神经系统、心血管系统等重要组织器官功能抑制甚至出现致死性的不可逆损害[15]。正因如此，内源性CO在20世纪90年代以前也被想当然的认为是一种机体代谢产生的有害废弃物。然而，近年研究发现，CO实质是一种类似于NO的重要气体信号分子，可通过活化鸟苷酸环化酶以升高细胞内环磷鸟嘌呤核苷浓度而发挥舒张血管、抑制血小板聚集等作用；同时，CO可通过活化p38-丝裂原活化蛋白激酶而减少血管内皮的细胞凋亡[16]；CO还能可调控p38MAP途径和RhoA及Akt途径间接抑制SMC增殖[17]；此外，CO可通过抑制单核/巨噬细胞的toll-like受体而下调核因子κB的活化[18]以及通过抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达，最终改变巨噬细胞的分化与极化，使其由促炎性的M1型向抗炎性的M2型分化，从而降低促炎细胞因子表达并增加抗炎细胞因子的表达，其结果是不仅能抑制炎症，还具有降低补体活化等免疫调节作用，这在抗AS和抗移植物排异反应中均具有重要意义[19]；最后，HO-1/CO与一氧化氮合酶/NO之间还可以彼此调节，增加HO-1蛋白活性及CO生成便可抑制诱导型一氧化氮合酶表达与NO产生，从而抑制炎症，反之，抑制 HO-1/CO则可活化诱导型一氧化氮合酶从而激发炎症反应[20]。

3.3 Fe2+的释放与安全清除在HO-1抗氧化应激中的作用

Fe2+是HO-1催化降解游离血红素必然要生成的产物。研究发现，在AS病变处的各种细胞内均有Fe2+的过度聚集现象，Fe2+客观上会通过芬顿(Fenten)反应生成大量的ROS而诱导氧化应激，然而，诱导HO-1表达的损伤因素通常也会同步上调铁蛋白表达，后者能通过螯合作用有效清除细胞内的Fe2+，其净效应实际上起到了抗氧化应激的作用[21]。此外，HO-1表达可能还参与上调超氧化物歧化酶的表达而发挥着一定程度的抗AS作用。

HO-1正是通过上述多种机制而在组织、细胞应对炎症与氧化应激损伤中发挥着不可或缺的保护作用。

4 HO-1表达抗AS的相关研究结果

Wang等[22]早期研究发现，Nrf-2调控的HO-1广泛表达于AS处的内皮细胞、血管SMC、巨噬细胞及泡沫细胞等各种细胞之中，但在邻近AS的正常血管组织细胞中 HO-1的表达却很低，当时尚不能确定HO-1诱导表达与AS之间的因果关系，但推测HO-1过表达可能是机体应对AS的一种适应性保护反应。Kawashima等[23]报道一例先天缺乏HO-1基因的患儿早年夭折，尸解发现其存在全身广泛炎症伴多发而严重的AS，因而支持HO-1实际上具有抑制炎症和抗AS的作用。这一点也在随后的多个动物实验研究中得到进一步证实，例如给载脂蛋白E缺乏的小鼠敲除HO-1基因会加重血管炎症、促进AS的发生发展，反之，以腺病毒作载体转染HO-1基因则可显著减轻AS病变[24]；Li等[25]用药物诱导HO-1高表达同样能有效抑制高脂喂养的兔发生AS病变，而使用锌原卟啉(Znpp)Ⅸ抑制HO-1的活性则可加重AS程度，此外，抑制HO-1的活性还可减少AS斑块的纤维帽厚度、扩大脂质坏死核心，从而增加斑块的易损性。临床研究揭示，人类的HO-1基因启动子中存在着一个由GT 二核苷酸重复序列组成的微卫星结构—(GT)n，不同个体间的(GT)n长度存在高度多态性并因此决定着HO-1基因的转录表达活性，(GT)n序列越长，HO-1的转录活性就越低，已有多个基于不同种族人群的研究均显示，(GT)n长度与个体罹患AS及冠心病的风险呈密切负相关[26-27]；另有调查显示,与HO-1的表达水平有关联的血浆胆红素浓度与冠心病的风险也呈显著负相关,提高血浆胆红素浓度具有抑制炎症和防止冠心病的效果[28]，这些都证明HO-1在人体同样具有重要的抗AS作用。甚至 HO-1基因中的(GT)n多态性直接决定着内皮细胞HO-1的基础表达水平，并因此决定着患者AS与冠心病的易感性[29]。近年研究显示，HO-1的抗AS作用包括全身性系统性保护和血管局部保护两方面。系统性保护体现在诱导HO-1高表达可抑制循环中的血红素水平、降低LDL氧化修饰产物ox-LDL浓度以及减少诸如MCP-1等炎症因子的表达[30]；血管局部保护则体现在基础状态的HO-1表达和诱导状态下的HO-1高表达都在血管组织的各种细胞成分中发挥着相应的抗AS作用，具体包括：HO-1在内皮细胞中的表达不仅能减轻氧化应激性细胞损伤，还能有效抑制血管内皮表达血管细胞黏附分子-1 、MCP-1等黏附分子及炎症因子，因而在抗AS发生、发展中起着关键作用[31]；HO-1在单核/巨噬细胞中的诱导表达则可以改变其自身的活化与极化类型，即由促炎性的M1型转化为抗炎性的M2型，从而降低IL-1、IL-6、细胞间黏附分子-1等促炎细胞因子表达，增加IL-10、精氨酸酶1、转化生长因子-β等抗炎细胞因子表达，如此，则巨噬细胞原本的致AS作用将可能转变为抗AS作用[32]； HO-1在SMC中的表达既能遏制其增殖以抑制AS进展，又能减少其凋亡以利于保持斑块的纤维帽厚度，从而增加斑块的稳定性[33]。

5 调控HO-1表达所面临的问题及临床应用展望

尽管上调HO-1表达被认为是组织细胞应对损伤性刺激的一种内源性的适应性保护方式，且多项研究均表明HO-1/胆红素/CO共同组成的内源性保护系统在拮抗AS中具有不可或缺的作用。但需要注意的是，HO-1表达的增多是否与抗AS的获益呈现出正相关的关系尚无定论，同时由于安全性、有效性和组织靶向性的制约，以基因转染调控人体组织、器官内HO-1表达水平的技术远未成熟，诱导HO-1的表达以拮抗AS尚无法用于临床；如前所述，绝大多数能诱导HO-1表达的损伤性刺激因素也都无法安全用于临床。目前比较有前景的发现是姜黄素及他汀类药物能够有效诱导HO-1表达，但初步研究揭示显著诱导HO-1表达所需的他汀类药物剂量可能远超临床常规用量[34]，而中国人对大剂量他汀类药物耐受性普遍较差却是一个不可忽视的限制因素。相比较而言，人能耐受的姜黄素安全剂量很高，故姜黄素可能是更有临床应用价值的HO-1诱导剂，尽管存在种种制约，但我们仍相信在科学技术日新月异的今天，一定能够通过合理调控HO-1表达给AS相关性疾病的防治带来新的曙光。

[1] Jones Buie JN,Goodwin AJ,Cook JA,et al.The role of miRNAs in cardiovascular disease risk factors[J].Atherosclerosis,2016,254:271-281.

[2] Xu Y,Zhu J,Hu X,et al.CLIC1 inhibition attenuates vascular inflammation,oxidative stress,and endothelial injury[J].PLoS One,2016,11(11):e0166790.

[3] Bryk D,Olejarz W,Zapolska-Downar D,et al.The role of oxidative stress and NADPH oxidase in the pathogenesis of atherosclerosis[J].Postepy Hig Med Dosw,2017,71(0):57-68.

[4] Araujo JA,Zhang M,Yin F.Heme oxygenase-1,oxidation,inflammation,and atherosclerosis[J].Front Pharmacol,2012,19(3):119.

[5] Chertok VM,Kotsiuba AE,Kotsiuba EP,et al.Heme oxygenase-2 neurons brain and spinal cord of human[J].Vestn Ross Akad Med Nauk,2012,(6):36-41.

[6] Abraham NG,Kappas A.Pharmacological and clinical aspects of heme oxygenase[J].Pharmacol Rev,2008,60(1):79-127.

[7] Kirkby KA,Adin CA.Products of heme oxygenase and their potential therapeutic applications[J].Am J Physiol Renal Physiol,2006,290(3):F563-F571.

[8] Haines DD,Lekli I,Teissier P,et al.Role of haeme oxygenase-1 inresolution of oxidative stress-related pathologies: focus on cardiovascular,lung,neurological and kidney disorders[J].Acta Physiol,2012,204(4):487-501.

[9] Gazzin S,Vitek L,Watchko J,et al.A novel perspective on the biology of bilirubin in health and disease[J].Trends Mol Med,2016,22(9):758-768.

[10] Altuner Torun Y,Ertural U,Ergul AB,et al.Reduction in serum paraoxonase level in newborns with hyperbilirubinemia as a marker of oxidative stress[J].Matern Fetal Neonatal Med,2016,9:1-4.

[11] Wu TW,Fung KP,Wu J,et al.Antioxidation of human low density lipoprotein by uncojugated and conjugated bilirubins[J].Biochem Pharmacol,1996,51(6):859-862.

[12] Zahir F,Rabbani G,Khan RH,et al.The pharmacological features of bilirubin: the question of the century[J].Cell Mol Biol Lett,2015,20(3):418-447.

[13] Baranano DE,Rao M,Ferris CD,et al.Biliverdin reductase:a major physiologic cytoprotectant[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(25):16093-16098.

[14] Ollinger R,Yamashita K,Bilban M,et al.Bilirubin and biliverdin treatment of atherosclerotic disease[J].Cell Cycle,2007,6(1):39-43.

[15] Bleecker ML.Carbon monoxide intoxication[J].Handb Clin Neurol,2015,131:191-203.

[16] Fujimoto H,Ohno M,Ayabe S,et al.Carbon monoxide protects against cardiac ischemia--reperfusion injury in vivo via MAPK and Akt--eNOS pathways[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2004,24(10):1848-1853.

[17] Rochette L,Cottin Y,Zeller M,et al.Carbon monoxide:mechanisms of action and potential clinical implications[J].Pharmacol Ther,2013,137(2):133-152.

[18] Wang XM,Kim HP,Nakahira K,et al.The heme oxygenase-1/carbon monoxide pathway suppresses TLR4 signaling by regulating the interaction of TLR4 with caveolin-1[J].J Immunol,2009,182(6):3809-3818.

[19] Sarady JK,Otterbein SL,Liu F,et al.Carbon monoxide modulates endotoxin-induced production of granulocyte macrophage colony-stimulating factor in macrophages[J].Am J Respir Cell Mol Biol,2002,27(6):739-745.

[20] Li T,Tian H,Zhao Y,et al.Heme oxygenase-1 inhibits progression and destabilization of vulnerable plaques in a rabbit model of atherosclerosis[J].Eur J Pharmacol,2011,672(1-3):143-152.

[21] Juckett MB,Balla J,Balla G,et al.Ferritin protects endothelial cells from oxidized low density lipoprotein in vitro[J].Am J Pathol,1995,147(3):782-789.

[22] Wang LJ,Lee TS,Lee FY,et al.Expression of heme oxygenase-1 in atherosclerotic lesions[J].Am J Pathol,1998,152(3):711-720.

[23] Kawashima A,Oda Y,Yachie A,et al.Heme oxygenase-1 deficiency: the first autopsy case[J].Hum Pathol,2002,33(1):125-130.

[24] Yet SF,Layne MD,Liu X,et al.Absence of heme oxygenase-1 exacerbates atherosclerotic lesion formation and vascular remodeling[J].FASEB J,2003,17(12):1759-1761.

[25] Li T,Tian H,Zhao Y,et al.Heme oxygenase-1 inhibits progression and destabilization of vulnerable plaques in a rabbit model of atherosclerosis[J].Eur J Pharmacol,2011,672(1-3):143-152.

[26] Chen YH,Lin SJ,Lin MW,et al.Microsatellite polymorphism in promoter of heme oxygenase-1 gene is associated with susceptibility to coronary artery disease in type 2 diabetic patients[J].Hum Genet,2002,111(1):1-8.

[27] Kaneda H,Ohno M,Taguchi J,et al.Heme oxygenase-1 gene promoter polymorphism is associated with coronary artery disease in Japanese patients with coronary risk factors[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(10):1680-1685.

[28] Schwertner HA,Vitek L.Gilbert syndrome,UGT1A1*28 allele,and cardiovascular disease risk: possible protective effects and therapeutic applications of bilirubin[J].Atherosclerosis,2008,198(1):1-11.

[29] Taha H,Skrzypek K,Guevara I,et al.Role of heme oxygenase-1 in human endothelial cells:lesson from the promoter allelic variants[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2010,30(8):1634-1641.

[30] Liu D,He Z,Wu L,et al.Effects of induction/inhibition of endogenous heme oxygenase-1 on lipid metabolism,endothelial function,and atherosclerosis in rabbits on a high fat diet[J].J Pharmacol Sci,2012,118(1):14-24.

[31] Sacerdoti D,Colombrita C,Ghattas MH,et al.Heme oxygenase-1 transduction in endothelial cells causes downregulation of monocyte chemoattractant protein-1 and of genes involved in inflammation and growth[J].Cell Mol Biol,2005,51(4):363-370.

[32] Wilson HM.Macrophages heterogeneity in atherosclerosis—implications for therapy[J].J Cell Mol Med,2010,14(8):2055-2065.

[33] Cheng C,Noordeloos AM,Jeney V,et al.Heme oxygenase 1 determines atherosclerotic lesion progression into a vulnerable plaque[J].Circulation,2009,119(23):3017-3027.

[34] Kwok SC,Samuel SP,Handal J,et al.Atorvastatin activates heme oxygenase-1 at the stress response elements[J].Cell Mol Med,2012,16(2):394-400.