潼白蒺藜药对调节高脂血症模型大鼠血脂作用及机制研究＊

杨爱玲，樊 华，王佑华＊＊，彭珑萍，周 莉，汤 诺，邓 兵，周 端

（1.上海中医药大学附属龙华医院心内科 上海 200032；2.上海市徐汇区中心医院中医科 上海 200031）

高脂血症在心脑血管疾病和发展过程中起着重要作用，人群血脂水平的大幅度提升是我国冠心病发病率和死亡率增加的最主要致病性因素[1,2]。调节血脂代谢紊乱，降低血脂水平可明显降低冠状动脉硬化性心脏病和中风的发生率[3,4]；有效地控制高脂血症是预防心脑血管疾病的关键。从中医药中寻找更多安全、有效的调脂药物是医药学界关注的热点和难点。

药对又称对药，是临床中药配伍中相对固定的两味药物的搭配形式。药对体现了中医遣方用药的特色优势，具有内在的组合变化规律，发挥着协同增效或配伍减毒等作用[5,6]。潼蒺藜、白蒺藜药对是临床常用药对，名医施今墨先生即善用潼白蒺藜药对治疗心血管在内的诸多疾病[7]。白蒺藜以升为主，潼蒺藜以降为要。二药伍用，一升一降，肝肾同治，平肝滋肾之功益彰，兼以祛瘀泻湿，适用于高脂血症的治疗。我们以潼白蒺藜药对制成潼白颗粒，临床收到较好效果。本研究采用高脂血症大鼠模型，观察潼白颗粒对高脂血症大鼠血脂水平调节的作用及机制，报道如下。

1 材料

1.1 实验动物

健康雄性SD大鼠48只，SPF级，6-8周龄，体质量180±20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2015-0001。饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养环境温度在24±2℃之间，湿度为40%±5%，定期更换垫料，自由采食、饮水，每天给予光照与黑夜时间各12 h。

1.2 药物及试剂

潼蒺藜及白蒺藜药材药材饮片及购自上海华济药业有限公司，批号：16113004，药物经我院药剂科制备成水提物颗粒，4℃冷藏备用。辛伐他汀片购于杭州默沙东制药有限公司；甘油三酯（TG）试剂盒、胆固醇（TC）试剂盒、高密度脂蛋白（HDL-C）试剂盒及低密度脂蛋白（LDL-C）试剂盒购于南京建成生物有限公司；Real time PCR（RT-PCR）试剂盒及Trizol购于TaKaRa公司；全部引物由上海生物工程股份有限公司合成；BCA蛋白定量测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自碧云天公司；二抗辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，一抗兔抗鼠HMGCR、CYP7A1、LDL-R均购自美国Abcam有限公司。

1.3 仪器

Olympus AU27oo全自动生化分析仪（日本）；L720R-3低温离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；电子分析天平（沈阳龙腾电子称量仪器厂），Rt2100c酶标检测仪（中国Rayto公司），QuantStudio Real-Time PCR仪（美国ABI公司），ChemiDoc MP成像仪（Biorad）。

1.4 饲料

正常大鼠饲料组成：蛋白质（14%），脂肪（10%）和碳水化合物（76%）。高脂饲料组成：标准的大鼠饲料辅以胆酸（1%），胆固醇（3%）和花生油（5.5%），购于上海中医药大学动物实验中心。

2 方法

2.1 动物分组及喂养

适应性喂养1周后，将大鼠随机分为正常对照组，模型组，辛伐他汀组、白蒺藜组、潼蒺藜组及潼白蒺藜组，每组各8只。参照文献[8]制备高脂血症大鼠模型，正常对照组饲喂基础饲料，其余各组大鼠均用高脂饲料喂养，周期共6周。

表1 各基因引物序列

2.2 给药剂量及方法

在造模的同时给予预防性灌胃给药，按等效临床剂量及体表面积公式计算，辛伐他汀组给予辛伐他汀7.5 mg·kg-1·d-1，白蒺藜组给予白蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼蒺藜组给予潼蒺藜水提物600 mg·kg-1·d-1，潼白蒺藜组给予潼白蒺藜药对水提物（潼蒺藜：白蒺藜=1∶1）600 mg·kg-1·d-1，正常对照组及模型组灌以等剂量的蒸馏水，给药容积为10 mL·kg-1·d-1，每天1次，共持续6周。

2.3 血液及组织样本采集

于给药第6周末，各组大鼠均禁食12 h，不禁水，于次日上午称体质量后用乙醚全麻，腹主动脉取血，收集血浆2 mL，静置30 min，于低温离心机4℃，3000 r·min-1，离心5 min，分离血清，-20℃冰箱保存待测。解剖大鼠，快速取出肝、肾、心等脏器组织，称取质量，计算脏器指数[脏器指数（%）=脏器质量（mg）/体质量（g）×100%]；将肝组织部分迅速置于非冻型组织RNA保存液中，部分保存于-20℃冰箱中，待测。

2.4 血脂测定

在全自动生化分析仪上，用酶法测定TC、TG含量。免疫比浊法测定LDL-C、HDL-C含量。

2.5 肝组织中HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA表达水平的测定

Trizol处理各组肝脏组织，提取总RNA，逆转录成cDNA，设定PCR反应条件，用SYBER Green试剂盒，以18sRNA为内参，应用RT-PCR法检测待测基因的mRNA水平，循环条件为：95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃20 s，72℃30 s（40个循环）。各基因引物序列如表1。

2.6 肝组织中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表达水平的测定

蛋白裂解液提取各组肝脏组织蛋白，利用BCA（Bicinchoninic acid）法对蛋白进行定量。以30 μg蛋白/泳道上样，经SDS-PAGE电泳后，用湿转法将蛋白转印置于甲醇活化后的PVDF膜上，blocking buffer室温封闭30 min后，进行一抗（浓度为1∶1000）4℃孵育过夜（≥12 h），并与β-actin作为内参抗体。孵育完毕后，磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBST）漂洗10 min×4次后进行HRP偶联的二抗（浓度为1 3000）室温孵育1 h，PBST漂洗5 min× 3次后在Biorad ChemiDoc MP显影仪中用ECL发光液进行化学发光显影。

表2 各组体重及脏器指数比较

表3 各组血脂比较

3 统计学处理

RT-PCR结果采用相对定量-△△Ct法分析。蛋白灰度值采用Biorad公司Image Lab®软件进行定量分析，所有实验结果采用SPSS21.0软件进行检验，用x±s表示，其中多组间均数比较采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，进一步两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 各组体重及脏器指数比较

如表2所示，造模四周后各组大鼠体重、肾指数及心指数没有明显变化（P均＞0.05），与正常组相比，模型组肝指数显著增加，与模型组比较，辛伐他汀组、潼蒺藜组、白蒺藜组及潼白蒺藜组肝指数有显著降低（P＜0.05或P＜0.01），各药物之间肝指数没有明显变化。

4.2 各组血脂比较

如表3所示，与正常对照组相比，模型组血清CHOL，TG，LDL-C均明显升高，而血清HDL-C明显降低（P均＜0.01），说明高脂血症大鼠模型成功建立。与模型组相比：辛伐他汀组TG、TC及LDL-C明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C没有明显变化。白蒺藜组TG、TC及LDL-C明显下降（P＜0.05或P＜0.01）。HDL-C没有明显变化。潼蒺藜组TG、TC及LDL-C明显下降（P＜0.01），HDL-C明显上升（P＜0.05），潼白蒺藜药对组TG、TC及LDL-C明显下降（P＜0.01），HDL-C明显上升（P＜0.01），其中以潼白蒺藜药对组降脂作用更加明显。

4.3 各组肝组织中HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相对表达水平比较

如表4所示，与正常对照组比较，模型组HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表达水平明显下降（P＜0.01）。而与模型组相比，辛伐他汀组、白蒺藜组、潼蒺藜组、潼白蒺藜组HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA表达水平均明显上升（P＜0.01）。其中潼白蒺藜组CYP7A1、LDLR mRNA表达变化更为明显。

4.4 各组肝组织中HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表达水平比较

如图1所示，与正常组比较，模型组HMGCR、CYP7A1、LDLR蛋白表达水平明显下降（P＜0.01）。与模型组相比，辛伐他汀组、白蒺藜组、潼蒺藜组、潼白蒺藜组HMGCR、CYP7A1、LDLR表达水平均明显上升（P＜0.05或P＜0.01）。其中潼白蒺藜组CYP7A1、LDLR表达变化更为明显。

5 讨论

中医学多把高脂血症归属于痰浊、血瘀、胸痹、眩晕、肥胖、污血、中风等范畴，认为与肝脾肾等脏相关。肝失条达，肝脾失调，气血失和，脾胃运化受纳和升清降浊失常，致膏脂转运输布不利，久则脂浊滞留于营血，停于血脉，形成高梁之疾。此外，肾为先天之本，主津液。肾精亏耗则水不涵木，肝木失其疏泄，则脂质代谢失调，发展为高脂血症。刺蒺藜功在疏肝解郁、祛风明目、散结祛瘀，潼蒺藜则着重于补益肝肾、明目固精，二者为临床常用药对，二药一升一降，肝肾同治，升降调和，理气散瘀，平补肝肾之功增强。清代名医施今墨常以刺蒺藜与潼蒺藜药对共伍，治疗包括高脂血症在内的诸多心血管病证肝肾不足者，二药合参，一散一补，一平肝阳以治上，一补肾阴以治下，肾气得充，肝得疏泄，气血通畅，发挥治疗作用。

图1 各组HMGCR、CYP7A1、LDLR mRNA相对表达水平比较

图2 各组肝组织中HMGCR、CYP7A1、LDL-R蛋白表达水平比较

现代医学表明，高脂血症是指血清中脂质成分过剩的状态，是由于脂肪代谢或运转异常所导致。血清总胆固醇TC、甘油三酯TG、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇HDL-C是反映机体脂质代谢的主要指标[9,10]。而肝脏是体内脂质代谢的重要器官，研究发现，长期饲喂高胆固醇饮食后，会引起肝肿大[11]。另外，TC合成、吸收、代谢在高脂血症发生发展中具有重要作用。一方面，在合成过程中，TC受其限速酶HMG的调节[12]，而HMGCR的浓度亦受TC的反馈调节，TC浓度升高会导致HMGCR蛋白水平降低，进而使TC的生物合成减少，达到动态平衡。故通过调节HMGCR蛋白水平可以起到减少TC生成的作用。另一方面，在TC的代谢过程中，合成胆汁酸是TC代谢的一个重要途径，而CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶[13]，它的表达量和活性对胆汁酸的合成起关键作用。当发生高脂血症时，CYP7A1活性表达下降，使TC代谢受阻，此时TC不能转变为胆汁酸，沉积体内，导致TC增高；同时，LDL-R是另一条维持机体血浆LDL-C水平及血脂代谢的重要途径，血浆中90%的胆固醇通过LDL-R途径清除[14]。LDL-R是细胞表面的一种糖蛋白，主要在肝脏中合成，当LDL-R的数量、结构及功能异常时，会导致TC含量升高，并在组织内沉积，进而导致各种心血管疾病的发生[15]。而高TC反过来影响肝细胞表面LDL-R受体,使其活性减弱，肝细胞摄取、转化及排泄LDL-C减少，进一步引起血中TC和TG升高[16]。

以往研究报道潼蒺藜、白蒺藜具有降脂作用[17-19]，但其机制尚未明确，潼白蒺藜作为药对使用对高脂血症的作用机制亦鲜有报道。本研究结果显示，高脂饲料喂养后大鼠血清TG、TC、LDL-C明显增加，HDL-C明显降低，大鼠肝指数显著升高，表明高脂模型建立成功。潼蒺藜、白蒺藜及潼白蒺藜药对干预后，明显降低大鼠血清TG、TC、LDL-C及肝指数，明显升高HDL-C，提示潼蒺藜和白蒺藜具有降低血脂，保护肝脏的作用，与既往研究一致。且与单用潼蒺藜或白蒺藜相比，潼白蒺藜药对组降低TC与LDL-C的效果更加显著。提示应用潼白蒺藜药对治疗高脂血症，或有协同增效的作用。同时，PCR及Western blot结果显示白蒺藜组、潼蒺藜组及潼白蒺藜药对组可明显提高HMGCR、CYP7A1、LDL-R mRNA及蛋白表达水平，且与单用潼蒺藜，白蒺藜相比，潼白蒺藜药对升高CYP7A1、LDLR蛋白水平的效果更加显著。提示潼白蒺藜药对可能通过调节HMGCR表达进而减少TC生成，同时促进CYP7A1、LDL-R的表达，既促进TC转化为胆汁酸，又增加TC的逆转运，从而降低血清TC水平起到降脂的作用。

综上所述，潼白蒺藜药对可通过调节HMGCR的表达来减少TC的生成，并通过提高CYP7A1、LDLR活性及表达来促进TC的代谢，进而降低血浆血浆TC含量，对高脂血症具有一定的治疗作用并且发挥协同作用。本研究为临床应用潼白蒺藜药对治疗高脂血症提供了重要的参考意义，其具体的作用机制及潼白蒺藜配伍应用的独特疗效仍需进一步研究。