水稻叶色突变研究进展

赵绍路，刘 凯，宛柏杰，朱静雯，刘艳艳，唐红生，严国红，孙明法

（江苏沿海地区农业科学研究所，江苏盐城224000）

水稻是我国主要的粮食作物，也是基因功能研究的模式植物。提高水稻叶片中的叶绿素含量，可以增加水稻的生物产量，因而具有超高产潜力的水稻品种往往表现为植株光合作用能力强，后期不早衰，抗逆性也显著高于一般品种。水稻收获籽粒中80%以上的干物质是开花以后通过光合作用获得的[1]，因此对水稻叶色突变体的研究将有助于探索植物光合作用、光形态建成、叶绿素生物合成与降解途径的分子机制等生理过程。目前水稻叶色突变体已直接应用于杂交水稻制种和F1种子纯度鉴定中，具有广阔的市场前景。因此通过不断挖掘新的水稻叶色变异材料，阐述水稻叶色突变基因的分子遗传机制，将具有重要的理论和实践价值。

1 水稻叶色突变的概念

水稻叶色突变是自然界中比较常见的一种突变性状，一般是指叶片中叶绿素的合成或降解受到不可避免的影响，从而造成叶绿素含量的改变，表现出不正常的绿色。前期研究者认为叶色突变可能会影响植株的光合作用，抑制水稻的正常生长，进而造成农作物减产。叶色突变材料是研究植物光合效率、叶绿体产生、叶绿体结构、叶绿素合成和代谢途径及其分子遗传机制的理想对象[2]。到目前为止，在其他植物中，如拟南芥[3]、菊花[4]、羊茅[5]等多种植物中均有叶色变异材料的报道。

2 水稻叶色突变体的分类

水稻叶色突变体除了少量的自然突变以外，绝大部分是研究者通过物理诱变、化学诱变、射线辐射以及T-DNA插入等方式诱发获得的突变，因此水稻叶色突变体的变异类型十分丰富，一般根据苗期不同的叶色表现可将其划分为转绿型、白化、黄化、条纹、斑马纹以及黄色斑点共6种类型[6]。也有一些突变体在营养生长期并不表现出叶色变异，到了生殖生长期才有所表现，如水稻滞绿突变体[7]。此外，水稻叶色突变受环境因素的影响较大，例如温度、光照时间及光照度等，因而刘艳霞等将水稻叶色突变体划分为高温敏感型、低温敏感型和特殊温敏感型[8]。此外，Kusumi等根据叶色对光照的响应，将其划分为光诱导依赖和非依赖2种类型[9]。

3 水稻叶色突变相关基因分子遗传研究

水稻叶色突变体是一类较常见的变异表型，且变异类型较多。迄今为止，国内外对有关水稻叶色突变体的研究很多，据不完全统计，在Gramene（http://www.gramene.org/）网站上已公布的与水稻叶绿素含量相关基因超过140个，它们广泛分布在第1～第12号染色体上，目前已克隆水稻叶色相关基因37个，但尚未从第12号染色体上克隆出来（表1）。这些叶色基因的定位和克隆为深入阐释叶绿体功能和代谢途径的机制分析奠定基础。根据这些基因在叶绿体内的功能，可将其分为以下几类：叶绿素合成与代谢途径相关基因、叶绿体发育途径相关基因、质-核信号传导途径受阻相关基因等，下面作重点阐述。

表1 已克隆水稻叶色相关基因

3.1 叶绿素合成与代谢途径相关基因研究

叶绿素（chlorophyll,Chl）的生物合成是一个由多个基因和酶调控参与的生化过程，它起始于谷氨酸-tRNA，最终生成叶绿素a和叶绿素b[40]。叶绿素合成途径中任何一个基因和酶促反应发生变化，都会造成叶绿素合成受阻，引起叶色突变。OsSGR是Jiang等通过γ射线辐射水稻品种日本晴发现的一个与水稻叶绿素降解途径相关的基因，该基因被定位于水稻第9染色体，编码一个高度保守的蛋白，是具有水溶性的转运肽，亚细胞定位于类囊体膜上，在转录水平影响叶绿素的降解[7]。Cha等研究表明，OsSGR的功能与叶绿素降解调控有关，通过激发多个叶绿素降解酶（例如NYC、PPH、RCCR、PAO等）直接与LHCPⅡ（light-harvesting complexⅡ）结合，在类囊体膜上形成复合物，诱导LHCPⅡ降解，促使叶绿素的降解[41]。

Morita等利用电离辐射获得了NYC3突变体，图位克隆发现该基因位于水稻第6染色体着丝粒附近，编码1个α/β折叠水解酶家族蛋白，可能是1个叶绿素酶，但没有叶绿素酶的活性。NYC3在正常衰老叶片中的表达量很低，而在暗诱导后叶片中的表达量很高，在其他非光合组织中，如根部也有少量表达。NYC3突变体在黑暗诱导衰老叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量比野生型高，其他参数如Fv/Fm和细胞膜离子渗漏等指标都下降，说明NYC3是1个非功能型持绿突变体[28]。

Yamatani等利用碳粒子束获得了另一个水稻持绿突变体NCY4，图位克隆将该基因定位于第7染色体，为拟南芥THF1的同源基因[32]，而THF1编码1个多功能蛋白，参与植物体内糖信号转导、抗病机制和高光驯化等过程[42-43]。NCY4编码1个类囊体形成蛋白THF1，主要控制叶绿体中内囊体的形成，在叶绿素降解过程中起重要作用。对突变体进行暗处理后受衰老诱导且与叶绿素降解相关的基因，如OsSGR、NYC3、NYC1、NOL、OsRCCR1、OsPAO以及其他衰老诱导基因Osh36都得到上调表达，表明NCY4体内的衰老进程并未受阻，NCY4是1个非功能型突变体。然而与其他持绿突变体如NYC1、OsSGR、NOL和NYC3不同的是，在衰老的过程中NCY4的叶绿素荧光参数如Fv/Fm与野生型相比，维持在较高水平，且PSⅡ亚基的稳定性也比其他非功能型突变体的高。因而在今后的研究中要重点关注功能性的持绿突变体。

3.2 叶绿体发育途径中相关基因研究

水稻叶绿体是由细胞前质体分化发育而来，与水稻叶片的发育紧密相关。叶绿体的分化发育如果受到影响，将会导致叶绿体内部结构的缺陷、叶片中叶绿素含量以及其他光合色素比例的变化，因此叶绿体的发育也是一个十分复杂的过程。吴殿星等通过扫描电镜观察水稻不同叶色变异材料的叶绿体结构后，突变体的表型虽不一样，但是在突变植株的突变区域里叶绿体的发育均出现异常，发育明显迟缓[44]。例如温度对叶绿体发育产生影响，Suginoto等通过图位克隆的方法定位了一个温度敏感型叶色突变体V2，它编码一个位于线粒体上的鸟苷酸激酶，是影响水稻叶绿体发育途径过程中的关键因子，发生突变后该基因会导致水稻叶片出现白化表型[45]。Bang等克隆了ObgC基因，它编码SpoB相关的三磷酸鸟苷结合蛋白，对于叶绿体的发育非常重要，同时对水稻核糖体的生物合成也起到关键作用。ObgC基因敲除后，会导致植株中叶绿体发育延迟，叶片出现黄萎表型[34]。

3.3 核-质信号途径受阻相关基因研究

水稻核-质信号途径上的任何一个基因发生突变后，水稻叶绿体的发育就会受阻，并最终导致叶色出现变异。Xu等在水稻中克隆了PAPST1基因，该基因编码一个3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸转运蛋白，电镜观察发现突变体植株的类囊体发育存在缺陷，因此在水稻叶片发育早期就表现枯黄。亚细胞定位研究表明OsPAPST1基因位于水稻线粒体外膜和叶绿体外膜上，推测其可能作为3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸载体，在细胞核和叶绿体之间起到信号传导作用[11]。

一般研究认为，水稻核基因组与细胞质基因组之间存在相互关联，这种作用称之为核质互作。一方面，细胞核基因控制着质体的发育过程，如水稻核基因OsDVR发生突变后，致使叶绿体发育受到抑制，突变体就会表现出黄绿叶，导致植株生长进程缓慢[16]。另一方面，叶绿体发育受阻或损伤会通过信号反馈途径调控核基因的表达。在水稻叶绿体中，10%～15%蛋白由核基因编码，其余部分的蛋白由细胞核和叶绿体共同编码，两者之间的相互作用对于叶绿体行使正常功能是必需的。此外，在水稻中叶绿体的发育需要多个转录因子的辅助和参与，例如光敏色素互作因子和GLK2蛋白。水稻中定位于细胞核的Cga1就编码一个细胞分裂素应答的GATA转录因子，过表达该基因会导致水稻叶片变深绿、分蘖数减少，相反地，RNAi沉默Cga1则会造成水稻叶片中叶绿素含量减少、叶色变淡、分蘖数增加[14]。目前关于水稻核-质信号转导途径过程中的基因机制研究还处于比较初级的阶段，需要进一步挖掘叶色变异材料，更深入地阐述该途径中的分子机制。

4 水稻叶色突变体的应用与展望

植物叶色突变体是研究光合作用调控和叶绿体发育、代谢途径相关基因功能的快速有效途径，目前国内外学者已经发现超过190个水稻叶色变异突变体，通过图位克隆的方法获得突变基因，并利用分子遗传学对基因的功能进行了阐述，这些基因为叶绿体的发育机制及光合作用的调控机理提供新的分子依据。

笔者所在课题组于2015年在中熟中粳稻盐稻8号提纯复壮的试验田中发现1株衰老明显延缓的滞绿突变体，可以作为优良的种质资源加以利用。经连续多年的种植，表型稳定遗传，在自然条件下，突变体在苗期、分蘖期、灌浆初期的表型与野生型盐稻8号无显著差异，但在灌浆后期叶色仍保持浓绿，尤其是千粒质量极显著高于野生型。将该基因定位在第4染色体遗传距离为4.6 cM范围内，目前正在进行精细定位。同时以突变体为亲本配置了大量杂交组合，利用分子标记辅助选择将有利基因进行聚合育种，以其为培育高产水稻品种提供种质资源。目前已有研究者将叶色变异作为标记导入杂交水稻的母本当中，在杂交制种苗期就可以轻易的去除杂株，从而保持种子的纯度[46]。

虽然目前已经克隆了大量的水稻叶色突变基因，有关叶绿体发育、代谢途径及光合作用调控机理研究取得了不少进展，但叶绿体是一个具有复杂结构和功能的亚细胞系统，还存在许多未知的途径，所以叶绿体的发育机制及光合作用的调控机理还有待进一步的研究。需要学者发现更多的叶色变异，从基因层面上改良农作物，获得高光效的作物新品种，这对于保证我国粮食产量、促进农业生产和谐发展具有重要意义。