金荞麦总黄酮提取工艺优化研究

赵炎军　蔡田恬　钱松　吴凡　黄蓓蓓

[摘要] 目的 优选金荞麦总黄酮的最佳提取工艺。 方法 采用乙醇回流提取金荞麦方法，以总黄酮含量为评价指标，选择乙醇浓度、溶媒倍数、提取时间和提取次数进行单因素考察，并通过 L9（34）正交试验设计优化金荞麦总黄酮的提取工艺。 结果 建立了金荞麦总黄酮的最佳提取工艺： 向金荞麦药材粉末中加入15 倍量65%的乙醇，80℃水浴回流提取3 次，每次提取2.0 h。 结论 优化的提取工艺稳定、合理、可行，能正确反映金荞麦总黄酮含量。

[关键词] 金荞麦;总黄酮;提取工艺;单因素;正交设计

[中图分类号] R284.2          [文献标识码] B          [文章编号] 1673-9701（2018）34-0034-04

金荞麦[Fagopyrum cymosum（Trev.）Meisn]别名野荞麦、金锁银开、荞麦三七、苦荞头等，系双子叶蓼科荞麦属（Fagopyrum）植物，多见于海拔500～3000 m的阴湿山地、灌木丛、溪道旁等，资源非常丰富，为民间常用的清热解毒类中草药，临床应用也非常广泛[1，2]。现代临床上主要用于治疗阻塞性肺疾病[3，4]、肺脓肿[5]、支气管炎[6]、溃疡性结肠炎[7]、外感风热[8]等症。近年研究发现其具有较好的抗氧化[9，10]、降低血脂血糖[11，12]、抑制肿瘤[13]、抗菌[14]等作用，具有较高的研究价值。据相关文献报道，金荞麦的化学成分主要有黄酮类、甾体、有机酸类、萜类、苷类等，其中黄酮类成分是其主要的药理活性成分，主要包括芦丁、槲皮素木犀草素、表儿茶素、原矢车菊素等[15-17]。

金荞麦传统的入药部位是地下根，因加工的需求，其地上部分都被直接丢弃，造成严重浪费。本文首次选用金荞麦的全草作为研究对象，采用乙醇回流提取方法，通过单因素考察结合正交试验设计优化金荞麦总黄酮的提取工艺，以期能提高金荞麦资源的利用率，为金荞麦地上部分的开发利用提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

金荞麦源自浙江省杭州市五云山，秋季10月采摘，为多年野生金荞麦植物，经浙江中医药大学俞冰教授鉴定，为2015版《中国药典》蓼科荞麦属药用金荞麦[Fagopyrum cymosum （Trev.）Meisn]植株;芦丁对照品（≥98%，批号：100080-200707）购自中国食品药品检定研究所;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司];UV-2600a型紫外可见分光光度计[尤尼柯（上海）有限公司];HH-S 型电热恒温水浴锅（巩义市英峪予华仪器厂）;SHB-Ⅲ型循环水式真空泵（巩义市英峪高科仪器厂）;KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;JP-500B打粉机（永康市久品工贸有限公司）。

2 方法与结果

2.1 对照品与供试品溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备  精密称取105 ℃烘干至恒重的芦丁对照品20 mg，置100 mL 量瓶中，加适量70%乙醇，超声溶解，放冷，加70 %乙醇至刻度，摇匀，即得（浓度为0. 2 mg/mL）。

2.1.2 供试品溶液制备  准确称取金荞麦粗粉（药材粉碎过60目筛）5.0 g，置250 mL圆底烧瓶中，加20倍量70%乙醇，80℃水浴回流提取2 次，每次1 h，趁热减压抽滤2 次，合并滤液至250 mL容量瓶中，加70%乙醇定容到刻度，備用。

2.2 金荞麦总黄酮的含量测定

2.2.1 线性关系考察  精密吸取芦丁对照品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL，置于25 mL 量瓶中，再加1 mL 5% NaNO2 溶液，摇匀，放置6 min，加入1 mL 10%的Al（NO3）3 溶液，摇匀，放置6 min，再加入10 mL 4% NaOH溶液，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min，随行试剂做空白，于510 nm 波长处测定吸光度，得吸光度Y与芦丁浓度X（μg/mL）的回归方程：Y=11.589X+0.0439，R2=0.9999。结果表明：芦丁在8～48 μg/mL范围内具有良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验  精密吸取芦丁对照品溶液3.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm 波长处连续测定6 次，计算吸光度值的RSD为1.34%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 稳定性试验  精密吸取供试液1.0 mL，按“2.2.1”项在510 nm波长处，分别在0 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min时间点测定吸光度，计算RSD值为0.30%，表明供试品溶液在30 min内稳定。

2.2.4 重复性试验  取同批次的金荞麦粗粉，按“2.1.2”项平行制备6 份供试品溶液，按“2.2.1”项测定吸光度。计算RSD为0.13%。表明该方法重复性良好。

2.2.5 加样回收试验  精密称取适量已知含量的金荞麦粗粉9 份，每份2.5 g，分别精密加入已知药材粗粉总黄酮含量80%、100%、120%的芦丁对照品。按“2.1.2”项制备供试品溶液，取供试品溶液1.0 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同“2.2.1”，测定总黄酮含量，计算加样回收率。结果平均回收率为99.17%，RSD=2.23%。见表1。

2.2.6 含量测定  按2.1.2项方法制备供试品溶液，根据2.2.1项显色测定吸光度，按下式计算金荞麦总黄酮含量。

总黄酮含量（mg/g）=■

2.3 单因素试验

2.3.1 乙醇浓度的选择  称取金荞麦粗粉5.0 g，加20倍量乙醇，提取2次，每次1 h （提取温度是80℃，下同），考察不同的乙醇浓度（%）（60%、65%、70%、75%、80%）对金荞麦总黄酮含量的影响，测得总黄酮含量分别为87.81 mg/g、96.02 mg/g、80.04 mg/g、74.63 mg/g、68.79 mg/g，图1可见，随着乙醇浓度增大，总黄酮含量先升高，在乙醇浓度为65%时提取率最高，而后总黄酮含量逐步下降。因此，本研究中正交试验乙醇浓度因素的3个水平选择60%、65%和70%。

2.3.2 溶媒倍数的选择  加入浓度为65%的乙醇，提取2 次，每次1 h，考察不同的溶媒倍数（10 倍、15 倍、20 倍、25 倍、30 倍）对总黄酮含量的影响，测得总黄酮含量分别为81.61mg/g、86.42mg/g、96.10 mg/g、93.83 mg/g、89.82 mg/g，图2可见，随着乙醇用量的逐渐增大，总黄酮含量先升高后降低。当乙醇用量达20 倍时，总黄酮含量最高。因此，本研究中正交试验乙醇用量因素的3个水平选择15 倍、20 倍和25 倍。

2.3.3 提取时间的选择  加入20 倍量浓度为65%的乙醇，提取2 次，考察不同提取时间（1.0 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3.0 h）对总黄酮含量的影响，测得总黄酮含量分别为79.10 mg/g、98.48 mg/g、97.52 mg/g、93.73 mg/g、87.12 mg/g，圖3可见，随着提取时间的延长，总黄酮含量先升高后降低，提取时间为1.5 h 时提取率最高。因此，本研究正交试验提取时间因素的3个水平选择1 h、1.5 h 和2 h。

2.3.4 提取次数的选择  加入20 倍量浓度为65%的乙醇，提取时间为1 h/次，考察提取次数（1 次、2 次、3 次）对总黄酮含量的影响，测得总黄酮含量分别为75.24 mg/g、86.20 mg/g、89.31 mg/g，图4可见，随着提取次数的增多，总黄酮含量不断升高，其中2 次提取总黄酮含量增加较多，3 次提取总黄酮含量增加趋于平缓，因此，本研究正交试验提取次数因素的3个水平选择1 次、2 次和3 次。

2.4 总黄酮提取工艺优选

2.4.1 正交试验设计  根据单因素考察结果，分别选取乙醇浓度A（%）、溶媒倍数B（倍）、提取时间C（小时）、提取次数D（次）的 3 个水平进行L9（34）正交试验，以总黄酮含量Y（mg/g）为评价指标。正交试验因素水平及正交试验结果可见表2、3。

查方差分析表，F（0.05）（2，4）=6.94 ，F（0.01）（2，4）=18，由表3～4结果分析得到：A因素：无显著性影响，2>3>1;B因素：有显著性影响，1>2>3;C因素：无显著性影响，3>1>2;D因素：有显著性影响，3>2>1。

方差分析结果表明：各因素对总黄酮得率影响大小顺序：D>B>A>C，即提取次数>溶媒倍数>乙醇浓度>提取时间。由此得出金荞麦总黄酮最优提取方案为A2B1C3D3，即药材加15倍量65%的乙醇，回流提取3 次，每次提取2.0 h。

2.4.2 最佳工艺验证试验  为进一步验证所选条件的正确性与科学性，对所选最佳提取工艺进行放大验证性试验，以增加可信度，分别取100.0 g金荞麦粗粉进行3次试验，按拟定的最佳工艺进行回流提取，结果提取所得总黄酮含量均值为105.97 mg/g（RSD=0.35，n=3），验证试验结果表明该提取工艺表现稳定，合理可行，重现性好。

2.5 总黄酮含量比较

分别取金荞麦传统用药部位（根）的粗粉100.0 g进行3 次试验，按拟定的最佳工艺进行回流提取，与上述金荞麦（全草）提取所得黄酮含量比较结果见表5。由表5可看出，金荞麦传统用药部位（根）提取所得黄酮含量低于金荞麦（全草）提取结果，存在显著性差异（P<0.01），该结果与之前文献报道[7，18]的金荞麦地上部分含有更高黄酮含量的结论相吻合。

表5   金荞麦提取物中黄酮含量比较

注：与金荞麦全草提取的黄酮含量相比较，★★P<0.01

3 讨论

金荞麦是一种具有很高的营养价值和重要药用价值的国家二级保护植物，具有抗菌、抗感染、抗血小板聚集、祛痰镇咳、提高巨噬细胞的吞噬功能以及抗肿瘤等多种生物活性，这与金荞麦中含有黄酮类化合物如芦丁、槲皮素、山奈酚-3-芸香糖苷、槲皮素芸香糖苷-7-半乳糖苷等有关[19]。它们在植物体内大部分以与糖结合成苷的形式存在，极性较小，在水中的溶解度低于在乙醇中的溶解度，适合采用醇法提取，金荞麦含有的总黄酮尤以芦丁含量最高，所以本研究以芦丁为对照品，采用乙醇回流法提取金荞麦中的总黄酮。

总黄酮是广泛存在于中药中的一类重要的具有生物活性的物质，研究表明，中药中的黄酮具有巨大的开发和应用价值[20]。随着对药用植物金荞麦研究的不断深入，发现其地上部分较传统用药部位含有更高含量的黄酮类活性成分，而有关金荞麦地上部分提取工艺的研究鲜见报道，所以本研究将金荞麦地上部分也加以利用，按拟定的最佳工艺进行回流提取，结果黄酮含量高于传统用药部位，存在显著性差异（P<0.01）。此结果可为进一步保护金荞麦资源、开发扩大用药部位及提高资源的利用率提供一定的科学依据。

本研究采用正交试验设计的方法来优化金荞麦的提取工艺，正交设计因能够较全面地考察多因素多水平，方法简便，试验次数较少，实施较为简单，能筛选出影响指标的显著因素并给出最佳因素水平组合[21]，有利于实验的快速进展，在后期的研究中，将对金荞麦提取物中黄酮的种类及含量进行分析测定，以便对各有效成分进行有效地提取、纯化和分离，并进一步研究发掘金荞麦黄酮的其他生物功效。

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（收稿日期：2018-06-28）