HER-2核酸适配子的筛选及其对胃癌抗肿瘤活性的研究

张芸芸 丁进 华宏军 季峰 滕卫军⋆

浙江省是胃癌高发地区之一，尽管目前胃癌发病和死亡有下降趋势［1-2］，但胃癌患者确诊时多已处于晚期，5年生存率＜20%［2］，研究显示人表皮生长因子受体2（HER-2）过度表达在致瘤转化和胃癌的发生中起关键作用［3］。现有的HER-2单抗虽然能够有效抑制胃癌细胞生长，但肿瘤耐药现象仍然存在［4］，而HER-2核酸适配子经体外筛选，具有成本低，不引起机体免疫反应等优势，已在肿瘤基础研究领域得到应用，并已证实其对多种肿瘤具有抑制作用［3］。通过指数式富集的配体系统进化（SELEX）技术筛选出HER-2核酸适配子可以有效靶向杀伤胃癌细胞［5］。本文探讨HER-2核酸适配子对胃癌的抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 材料 用于SELEX筛选的DNA随机文库由上海生物工程技术有限公司合成。文库两端为固定序列，中间为40个碱基的随机序列。PCR扩增所用的引物由Primer5.0软件设计，上游引物5'标记nTc荧光标记。引物序列：上游引物（BI）序列：5'-FrI'CACcGACCGTGC'rGCACTCT-3'。下游引物（B2）序列：5'-CGCAACGCTCGCTCATAcT-3'。人胃癌细胞细胞株NCI-N87细胞购自中国科学院细胞库。无血清培养基keratinocyte-SFM、1640培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Dulbeeeo78磷酸盐缓冲液，酵母tR-NA购自Sigma公司。洗涤缓冲液（含4.5g/L葡萄糖及5mMMgCl2的Dulbecco's磷酸盐缓冲液），结合缓冲液（含有0.1mg/ml酵母tRNA和lmg/ml BSA的洗涤缓冲液）。

1.2 筛选HER-2的核酸适配子库 适配子筛选参照Dastjerdi KD的方法［6］采用SELEX技术。采用合作单位实验室已有的人cDNA文库为模板的基础上合成并建立随机ssDNA的文库，随机片段为40bp左右，总长为80bp～100bp。随机ssDNA文库、HER-2蛋白稀释液和selex binding buffer混匀后于37℃孵育40min；混合液滤过0.22μm的硝酸纤维素膜；selex washing buffer洗涤5次，去除非特异性结合的ssDNA；抽真空后加入selex eluting buffer于80℃作用10min，洗脱下与HER-2结合的ssDNA，经酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后，以此为模板进行PCR扩增。PCR反应体系及反应条件：模板2μl，10×PCR缓冲液10μl，MgCl26μl，dNTPs 100μmol/L，Taq酶2U，上游引物50pmol，下游引物1pmol，加去离子水至100μl。PCR反应条件：94℃预变性3min，94℃变性40s，最佳退火温度退火30s，72℃延伸45s。循环次数据实验而定。最后72℃延伸7min。核酸回收纯化后建立次级文库，并以此进行第二轮的筛选，直至完成10轮左右的筛选。最后扩增所得的文库为后续研究的核酸适配子。

1.3 核酸适配子的鉴定 适配子的克隆、测序：经10轮左右的筛选得到的ssDNA，对称PCR方法扩增为dsDNA，经回收试剂盒纯化回收后与pMD18-T Vector连接，转化DH5a感受态细胞，经鉴定后随机挑取阳性克隆菌进行亲和性测定，选择亲和性高的适配子进行测序。亲和性测定：（1）流式细胞术检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87胃癌细胞HER-2的亲和力（以荧光标记的适配子为探针）。数值表示法 mean fluorescence intensity（MFI）：（ 适 配 子 浓 度μM）阴性对照荧光强度，适配子的荧光强度。（2）ELISA检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的亲和力，将NCI-N87全蛋白裂解液1μg/ml包被96酶标孔板后，加不同浓度的生物素标记的HER-2适配子反应，最后用链霉亲和素-HRP酶复合物和TMB底物液显色，450nm吸光值高低代表HER-2适配子的结合水平及反应强度。（3）IPWesternblot免疫共沉淀法检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的亲和力，在1.5ml管子中加入：NCI-N87全蛋白裂解液250μg，不同浓度（0～100μM）的生物素标记的HER-2适配子，亲和素标记的agarose琼脂糖，用PBS补足1ml，4°冰箱旋转反应过夜。次日，反应液经离心洗涤后，沉淀物进行蛋白电泳和转膜，用抗HER-2抗体进行Western-blot检测。条带深浅即表示HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的结合量和结合力。

1.4 体外研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抑瘤活性 HER-2表达干预模型的建立：采用分子生物学技术，分别构建具有高效转染和表达特征的重组腺病毒Ad-HER-2（表达外源性HER-2的重组腺病毒）和Ad-HER-2-siRNA（特异性HER-2基因表达沉默的siRNA重组腺病毒）。将重组腺病毒分别转染胃癌细胞系SCG7901，经Western-blot及定量RT-PCR技术鉴定，建立过表达HER-2的胃癌细胞系SCG7901（转染Ad-HER-2），及HER-2表达抑制的胃癌细胞系NCI-N87（转染Ad-HER-2-siRNA），用于以下实验研究。细胞于含10%小牛血清（FBS）和1%青-链霉素的RPMI 1640培养液中，置95%空气湿度、5%CO2和37℃环境中培养。细胞增殖试验（MTT）：将各肿瘤细胞系细胞播种于96孔板。不同浓度的HER-2核酸适配子或稀释剂加入到样本中，细胞经37℃/CO2培养，用MTT法测定存活细胞的百分率，通过微孔读数器测570nm吸光度来决定存活细胞数量；用定量ELISA测定DNA合成期所结合的溴脱氧尿苷（BrdU）量来检测细胞增殖的情况；96孔板中，加NCI-N87细胞2000个/孔，24h后加入不同浓度（0～100μM）的适配子，1次/隔2d换新鲜培养液，加药后第6天用MTS法检测细胞增殖活力。应用流式细胞术Annexin V Assay检测各组细胞凋亡与增殖情况，以此筛选出具有高抗瘤活性的HER-2核酸适配子用于体内实验研究。

1.5 体内实验研究HER-2核酸适配子对高表达HER-2胃癌细胞的抗瘤活性 Balb/C裸鼠，皮下荷瘤NCI-N87细胞5X10E6个/只（n=3），荷瘤4d后，腹腔注射HER-2适配子40μg/（次·只），1次/周，共6次。同步同法以抗HER-2抗体［160μg/（次·只）］治疗作对照。末次注射后1周处死，剥离瘤体测量肿瘤大小，称重。肿瘤体积按照公式：长度×（宽度）2×0.5。

1.6 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件。计数资料组间比较用χ2检验，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HER-2核酸适配子的筛选及鉴定 筛选获得的胃癌细胞HER-2核酸适配子为：共86个核苷酸的序列5'-AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCTGCACTTGTCATT TTGTATATGTATTTGGTTTTTGGCTCTCACAGACACACT ACACACGCACA-3'。流式细胞术检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87胃癌细胞HER-2的亲和力，结果显示10μM HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有较好的反应。ELISA检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的亲和力，结果显示：0、0.1、1.0、10、100μM HER-2适配子浓度时的 A450nm 值分别为 0.08、0.17、0.54、1.68、2.27，可见10μM HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有较好的反应。IP-Westernblot免疫共沉淀法检测不同浓度HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2的亲和力，结果显示：10μM HER-2适配子对NCI-N87蛋白裂解液中HER-2具有较好的亲和反应。

2.2 体外实验分析HER-2核酸适配子在胃癌中的抗瘤活性 细胞增殖试验（MTS）结果显示：与抗HER-2抗体比较，10μM HER-2适配子对NCI-N87细胞增殖活力具有显著的抑制作用（见表1）。Annexin-V PI双染，流式细胞仪检测不同浓度（0～100μM）HER-2适配子诱导NCI-N87胃癌细胞凋亡，结果显示：0μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM的凋亡阳性率分别为（2.94±0.37）、（4.21±0.43）、（10.46±0.56）、（33.39±0.63）、（44.69±0.60），差异有统计学意义（χ2=512.38，P＜0.01）；与抗HER-2抗体的凋亡阳性率（20.39±0.55）比较，10μM HER-2适配子能显著诱导NCI-N87细胞的凋亡（χ2=24.24，P＜0.01）。

表1 不同浓度HER-2适配子对NCI-N87细胞增殖活力的抑制作用

2.3 体内实验分析HER-2核酸适配子在胃癌中的抗瘤活性 18例Balb/C裸鼠肿瘤模型建立后，随机分为HER-2适配子治疗组、抗HER-2抗体治疗组及未治疗组，每组各6只。结果显示，三组肿瘤重量差异有统计学意义（F=111.65，P＜0.01）；进一步采用SNK-q检验两两比较，HER-2适配子治疗组、抗HER-2抗体治疗组及未治疗组的肿瘤重量差异均有统计学意义（q=1.05、1.95、2.99，P＜0.05），即 HER-2适配子治疗组＜抗HER-2抗体治疗组＜未治疗组（见表2）。

表2 各组肿瘤大小与肿瘤比较

3 讨论

HER-2核酸适配子是一种人工合成的两端短的固定序列，具有较多连抗体均无法比拟的优点［6］：（1）适配子可以结合大分子如蛋白质和细胞，还可以结合小分子如核苷酸，氨基酸甚至金属离子，而抗体只能识别相对较大的能够引起免疫反应的分子。（2）适配子是体外筛选，筛选范围大，且不受生理环境的约束（如高低温或高低pH值环境等），而抗体无法做到。（3）适配子可以通过化学合成的方式迅速得到，生产成本较低；抗体制备周期约为3～6个月，成本高。（4）适配子可以根据目的不同而进行修饰，抗体不能实现。（5）适配子分子小，不会引起机体免疫反应。

目前，核酸适配子在肿瘤研究领域取得一定成果，但有关适配子在胃癌方面的证据依然不足。Meza-Junco J等［7］发现22%～28%胃癌细胞中存在HER-2过度表达，而HER-2过表达与肿瘤的分期、转移、复发密切相关。新近Balogh Z等认为核酸适配子完全可与单抗媲美［8］，Archemix公司生产的AS1411是第一个进入I期及II期临床试验的核酸适配子，并已得到证实，其对多种肿瘤细胞株（如急性髓系白血病和肾癌细胞）具有抑制作用，且疗效良好［9］。张宇等［10］证实应用HER能够有效抑制HER-2高表达胃癌细胞的作用。进而，西妥昔单抗可有效抑制裸鼠胃癌皮下移植瘤的生长及细胞增殖，促进细胞凋亡，但其耐药依然存在而影响效果［11］，而核酸适配子对紫杉醇耐药肺腺癌有效［12］。

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