豚鼠频闪光诱导性近视和形觉剥夺性近视外侧膝状体多巴胺含量的比较

佘曼，李炳，李涛，吉顺梅，郑昌月，周晓东

(复旦大学附属金山医院，上海 201508)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

近视是眼轴长度与屈光力不匹配，导致物体成像于视网膜前的一种临床常见的屈光不正，是眼科发病率最高的疾病[1]。生理状态下，外界视觉信号到达视网膜光感受器后，经过光电信号转换，经视神经及视束传递到外侧膝状体(lateral geniculate nucleus, LGN)，再由外侧膝状体发出的纤维投射到初级视皮层(17区)[2]。在这一完整视觉通路中，任何环节出现问题，都将影响最终的视觉感知[3]。其中，LGN越来越被视为处理视觉信息的“智能开关”，是中枢负责传递视觉信息的重要结构[4]。然而，目前近视发病机制的研究主要集中于眼球内的结构，如视网膜、巩膜等，很少涉及中枢外侧膝状体的研究。

形觉剥夺性近视(form deprivation myopia, FDM)和频闪光诱导性近视(flickering light-induced myopia，FLM)是两种不同的近视模型，研究表明神经递质5-羟色胺在这两种模型豚鼠视网膜的含量成相反趋势，提示这两种模型近视发病机制不同[5]。而多巴胺(dopamine, DA)是视网膜上另一重要的神经递质，参与信号级联控制着眼轴增长，对近视发生发展有重要作用[6]。本课题组前期研究发现视网膜DA在FDM及FLM两种模型含量不同。那么，不同的外界视觉信号通过视网膜传递到中枢LGN后，神经递质DA含量有何变化，在这两种不同的近视模型上又有何差别，这正是本实验的研究目的。基于此背景，本实验通过比较FLM及FDM两种近视模型LGN的DA含量变化，旨在对比中枢DA在这两种近视模型中的作用，初步探索近视的中枢发病机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级2周龄英国种短毛雄性三色豚鼠24只，屈光介质透明，无眼部疾患或先天畸形，体重为90～110 g。来源于上海甲干生物科技有限公司【SCXK(沪)2015-0005】，饲养于上海市公共卫生临床中心【SYXK(沪)2015-0008】，饲养环境保持室温24～26℃，相对湿度55%～65%。给予豚鼠充足饲料和饮水，并定期补充蔬果及维生素C。实验遵循实验动物3R原则。

1.2 实验方法

1.2.1 频闪光诱导性近视和形觉剥夺性近视模型的建立

24只豚鼠随机分为3组(n=8)：①频闪光诱导组(FLM组)，建模方法参照邸悦等[7]所用方法。②形觉剥夺组(FDM组)，豚鼠右眼遮盖半透明眼罩，并确保不影响眼睑正常活动，每天进行检查[8]。③对照组，不予特殊处理，室内采用周期12 h的正常光照。各组实验周期均为8周。

1.2.2 眼球生物测量

在造模前及造模后第8周分别测量各组豚鼠右眼屈光度和眼轴长度，以造模后测量值减去造模前测量值之差作为各生物参数变化值。

(1)屈光度测量方法：测量前使用复方托吡卡胺滴眼液(参天制药有限公司，中国)滴眼，每5 min一次，共滴4次，待瞳孔扩大后进行带状光检影验光(KJ6B，六六视觉，苏州)，等效球镜记为球镜+1/2柱镜，重复测量3次后取平均值作为该眼屈光度[9]。

(2)眼轴长度测量方法：使用Super SW1000眼科A超测量仪，A超频率为11 MHz。测量前先用盐酸奥布卡因滴眼液(参天制药公司 中国)表面麻醉，然后将探头垂直对准角膜中心表面，不压迫角膜，取稳定清晰图像，晶状体后囊膜和视网膜双峰均高于基线，每只眼测10次后取平均值，精确到0.01 mm。

1.2.3 高效液相色谱电化学检测法

将豚鼠腹腔注射过量戊巴比妥钠(0.2 mg/mL)安乐死后，迅速断头取脑，于冰上取左脑外侧膝状体，然后置于冻存管内放于液氮中，待取材完毕后精密称重，按1∶10体积加入匀浆液，冰上超声匀浆。14 000 r/min转速进行离心10 min，取上清液装入离心管并保存于-80℃冰箱待测。

用HPLC-ECD检测标本中DA浓度：每份样本取20 μL上清液注入38℃ Acclaim C18色谱柱(2.2 μm, 2.1 mm × 100 mm；Thermo Fisher Scientific)中，然后用磷酸盐缓冲液流动相以0.2 mL/min流速进行分离,检测室电压设置+0.7 V，安全室电压设置+0.75 V。所有数据均由ChemStation(安捷伦科技有限公司)进行采集和分析。通过与提前设定的已知标准进行比较得出峰值及相对浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 FLM及FDM模型的建立

2.1.1 造模前三组豚鼠右眼生物参数

实验造模前，三组豚鼠右眼屈光度、眼轴长度差异无显著性(P=0.876，P=0.857)。(见表1)

表1 造模前3组豚鼠右眼生物参数Tab.1 Biological parameter values of the right eyes in the three groups before modeling

2.1.2 造模第8周，三组豚鼠右眼生物参数变化值

造模第8周，FDM组与对照组相比，右眼屈光度变化值、眼轴长度变化值差异有显著性(P<0.001，P=0.008)；FLM组与对照组相比，右眼屈光度变化值、眼轴长度变化值差异有显著性(P<0.001，P=0.026)。(见表2)

2.2 HPLC-ECD测量外侧膝状体中DA含量

8周造模结束后，三组豚鼠左脑外侧膝状体DA含量分别为：对照组(n=7，因外侧膝状体取材时操作失误导致该数据流失)为(37.04±1.18)pg/μL；FDM组(n=8)为(24.27±3.46)pg/μL，与对照组相比差异有显著性(P=0.021)；FLM组(n=8)为(45.58±1.98)pg/μL，与对照组相比差异有显著性(P=0.01)。DA含量由高至低排列为：FLM组>对照组>FDM组。(见图1)

表2 造模第8周三组豚鼠右眼生物参数变化值Tab.2 Changes of biological parameter values of the right eyes in the three groups after 8-week modeling

注：与对照组比较，**P<0.001，*P<0.05。

Note. Compared with the control group.**P<0.001 and*P<0.05.

注：*表示与对照组相比，P<0.05。数据以均数±标准误表示。图1 对各组左脑外侧膝状体多巴胺含量进行定量分析Note. *P<0.05. All the data are expressed in (±s).Fig.1 Contents of dopamine in the left lateral geniculate nucleus of the three groups

3 讨论

本研究发现，频闪光照及形觉剥夺两种方法均能成功诱导出近视模型。FLM组LGN的DA含量升高，而FDM组DA含量减少，我们推测可能与这两种近视模型的发病机制不同有关。

DA是脑内重要的神经递质，主要由腹侧被盖区和中脑黑质致密体产生，再由这些区域发送扩散至脑内不同区域。DA纤维投射至中枢大多数结构如基底神经节、大脑皮层、海马、中脑和丘脑等[10]。而LGN则位于背侧丘脑，负责将视网膜接收的视觉信息传输至视皮层，其细胞发育对异常视觉环境非常敏感[11]。来自视网膜鼻侧的纤维交叉至对侧，与颞侧纤维共同形成视束，再通过神经节细胞(RGC)的突触传入将视觉信号传输至LGN，视觉信息经整合后再由丘脑皮层细胞发出纤维投射到初级视皮层(V1)，即构成了RGC-丘脑皮层细胞-V1的完整视觉通路[12]。对于视觉中枢的研究，多数实验都以此视觉通路作为研究对象，即对一侧眼进行干预而研究对侧中枢的变化[11, 13]。本实验通过形觉剥夺及频闪光诱导两种方法，观察造模后右眼的视觉变化，同时检测左侧LGN的DA含量。结果发现，通过频闪光诱导和形觉剥夺诱导的两种近视，其外侧膝状体DA变化呈相反趋势，频闪光照组外侧膝状体DA含量增多，而形觉剥夺组则DA减少，我们认为可能有以下几方面原因。

一方面，FDM模型是通过单眼遮盖或眼睑缝合等方法使视网膜成像不清而引起近视[14]。本次实验通过遮盖豚鼠右眼，成功建立了FDM近视模型。建模过程中，由于单眼形觉剥夺可促进视网膜神经末梢在外侧膝状体释放谷氨酸盐，提高NO浓度致使DNA断裂，从而诱发外侧膝状体神经元凋亡[15]。相似现象在兔外侧膝状体亦有报道[16]。因此我们推测FDM模型可能导致外侧膝状体多巴胺能神经元凋亡增加，从而出现DA分泌减少的现象。同时，乔淑红等[17]研究表明，与非剥夺眼相比，猫剥夺眼驱动的外侧膝状体细胞明显变小，视网膜传入纤维与LGN神经元突触联系显著减少。那么，LGN中DA水平下降可能因为形觉剥夺使视觉信息传入减少，神经冲动到达外侧膝状体的神经末梢后，LGN中与其进行突触连接的神经元减少，再通过一系列的信号转导调控，最终导致多巴胺能神经元分泌的DA减少，但仍需进一步实验证明。

另一方面，频闪光照组LGN的DA含量较正常组增多。本次实验采用二周龄豚鼠，饲养于亮1 s，暗1 s(频率为0.5 Hz)的特殊频闪光环境中。在其视觉形成的敏感期内，频闪异常光环境可能对中枢视觉加工产生重要影响。研究表明，DA可以调节视网膜到背外侧膝状体(dLGN)突触传递的兴奋性，减轻从视网膜到dLGN的兴奋性突触后电位(EPSC)，因此可以调节视网膜信号介导的dLGN神经元的激发方式[18]。而豚鼠LGN同其他哺乳动物类似，包含背侧核和腹侧核。其中背侧核体积大于腹侧核，且只有背侧核发出的纤维投射至视皮层[19]。因此我们认为豚鼠外侧膝状体DA水平增多的主要部位可能是背外侧膝状体，频闪光环境导致的DA增加可能正是为了抑制dLGN突触传递的兴奋性。研究发现，采用微离子电渗透向猫外侧膝状体施加DA，能改变丘脑中间神经元的视觉诱发反应，从而影响丘脑的视觉信息加工[20]。激活LGN的D1受体可以抑制大鼠dLGN的中间神经元活化[21]。而DA作用于LGN的D2受体则能促进GABA能中间神经元的活化，从而间接抑制dLGN神经元[22-23]。向兔静脉注射DA受体非选择性激动剂阿朴吗啡可减轻dLGN对正弦光栅闪光点的反应[24]。由此可见，DA可以调节视网膜到LGN突触传递的兴奋性。我们推测频闪光信号由视网膜传向LGN后，机体通过一系列调控反应，上调LGN的DA水平，从而抗衡中间神经元的过度兴奋。

FDM是经典且应用广泛的实验性近视模型，而FLM作为较新建立的动物模型，其发病机制仍需进一步研究。本次实验提示这两种模型的近视形成机制可能不同，从而导致LGN的DA水平呈相反趋势。在某种程度上，FDM是视觉信息传入减少，而FLM是闪光刺激频率增加，两者通过不同的作用方式，最终均形成近视。由于DA对LGN神经元的作用呈剂量依赖关系，高浓度DA抑制LGN神经元对视觉信息的反应，而低浓度则促进视觉反应[22]。因此我们推测LGN的DA浓度需维持在一个平衡状态，一旦外界视觉环境打破此平衡，都将可能导致近视，而这也正是我们课题组的研究重点。此外，LGN的多巴胺能神经元形态及功能是否因此改变，初级视皮层与其又有何联系，这是我们今后研究的另一重点，我们将继续探索近视模型中DA对完整视觉通路的影响，从而为近视防治提供更多实验证据。

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