大鼠腰椎腹侧神经根牵拉模型的建立

刘吉宏，葛立军，陈焱，张勇，陆嘉琦，刘爱莲，李宁，孙怀昌，王建飞，*

(1. 扬州大学兽医学院，扬州 225009； 2. 葛兰素史克(上海)医药研发有限公司, 整合生物科技平台, 上海 201203)

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肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)是一种进行性致死性神经系统变性疾病、选择性累及脊髓前角细胞和大脑神经皮质运动神经元[1]。患者常因呼吸困难、肺部感染、全身衰竭而死亡。全球每90 min就有一名ALS患者去世，被列为五大绝症之一[2-3]。关于ALS疾病的啮齿类动物模型目前主要是利用转基因技术生产一些特定位点突变的转基因动物模型，如：SOD1转基因小鼠、TDP-43转基因小鼠，Wobbler基因突变模型等，用于药物筛选[4-8]。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF) 是在脑内合成的一种蛋白质，它广泛分布于中枢神经系统内，在中枢神经系统发育过程中，对神经元的存活、分化、生长发育起重要作用，并能防止神经元受损伤死亡、改善神经元的病理状态、促进受损伤神经元再生及分化等生物效应，而且也是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能所必需[9-13]。然而，转基因动物因在动物发病过程，基因拷贝数目容易改变，不同性别发病过程不一等方面的原因，给科学研究及药物测试带来很大的困扰[14]。本文介绍一种手术诱导ALS大鼠模型，腹侧神经根牵拉(spinal root avulsion，SRA)模型，并用BDNF治疗以验证模型的重复性和可靠性。SRA模型是脊柱外牵拉不同位置神经根的一种轴索显微外科术的动物模型，主要引起脊髓腹前角中运动神经细胞由于缺少神经营养因子而变性死亡[15-19]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级SD雄性大鼠45只，体重180～200 g，6周龄，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司【SCXK(沪) 2013-0016】。手术及动物的饲养于上海西普尔-必凯实验动物设施内进行【SYXK(沪) 2013-0058】，采用常规大鼠饲料喂养，IVC饲养，自由活动和饮食。动物饲养室12 h/12 h昼夜交替，温度为(21+1)℃。本实验所有操作均符合中华人民共和国《实验动物管理条例》，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀，实验方案通过了葛兰素史克(上海)医药研发有限公司机构动物饲养管理和使用委员会(Institute of Animal Care and Use Committee, IACUC)审查批准，批准号为AUP0091。

1.1.2 试剂与仪器

莱卡实体显微镜(M651)，VMR小动物专用吸入麻醉机(Matrs VMR-VIP 3000)，异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，福尼辛葡甲胺(镇痛剂，齐鲁动物保健品有限公司)，水浴恒温T-pump(Gaymar-TP 650)，MRE025导管(美国Braintree科学公司)。微型泵Mini-pump 2002 (Alzet 2002 minipump), human BDNF (Novoprotein, Lot: E20130422B)。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立

SPF级SD雄性大鼠5 只，行脊髓腹侧神经根牵拉后，1周安乐死大鼠，取出脊髓第3～6腰段进行组织处理和抗胆碱乙酰转移酶(choline acetyl transferase, ChAT)抗体染色分析。

1.2.2 用BDNF治疗

SPF级SD雄性大鼠40只，随机分为4组，每组10只：分别为预防对照组、预防给药组、术后1周给药对照组、术后1周给药治疗组。大鼠进行脊髓腹侧神经根牵拉后，分别于手术立刻或手术1周后用BDNF (12 μg/d) 治疗(将BDNF于使用前1 d装入微型泵，过夜平衡以备用)2周，对照组用PBS。治疗2周后取材，动物麻醉后使用生理盐水和4%的多聚甲醛(paraformaldehyde, PFA)灌流，取出脊髓第3～6腰段进行ChAT染色分析。整个动物给药及后续病理实验均采用双盲方式。

1.2.3 手术步骤

使用吸入异氟烷麻醉大鼠(诱导浓度：5%；维持浓度：2%～3%)，背部剃毛并消毒，将动物放置于手术恒温热垫上，用手指感触两侧髂骨嵴，在与两侧髂骨嵴连线中点处做一个长约2 cm的背部皮肤正中切口，离脊柱大约5 mm的位置纵向切开左侧背长肌及韧带，切口长度在1.5 cm 左右，随后在实体显微镜下分离暴露第5腰椎的左侧乳突及横突，并用小剪刀去除部分乳突及大部分横突板，以暴露粗大的第四神经索，在第四腰椎的锥孔处用微型钳分离第4腰椎神经根(含背侧和腹侧)周围的组织，将其从锥孔中拉出少许，含有背根神经节的为背侧根，另外一条为腹侧根，随后用微型止血钳小心的将腹侧根完全拉出，整个腹侧根的长度在2 cm 左右。在造模后运动神经元变化的实验研究中，腹侧神经元牵拉后，缝合肌肉关闭伤口，注射氟尼辛5 mg/(kg·d)进行镇痛处理，术后48 h内，紧密观察动物情况，预防手术感染。样品采集时先使用吸入异氟烷将大鼠麻醉(诱导浓度：5%；维持浓度：2%～3%)，随后使用0.9%生理盐水和4% PFA灌流，在解剖显微镜下取出脊髓第3～6腰段进行后续组织处理和ChAT染色分析。而在BDNF治疗的实验中，牵拉后，立即从第4椎间孔中插入一个连接到微型渗透泵(Alzet 2002 minipump)的MRE025导管到蛛网膜下腔后，缝合肌肉关闭伤口，微型泵埋于颈部皮下，以0.5 μL/h的速率进行髓鞘内给药，持续14 d。在不同的时间终点，灌流后取出脊髓第3～6腰段进行染色分析。

1.2.4 术后护理

术后48 h内给大鼠皮下注射福尼辛葡甲胺5 mg/(kg·d)，并将动物置于37℃的恒温热垫上直到完全苏醒，苏醒后的大鼠3～5只群体饲养。

1.2.5 胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫组织化学染色

脊髓经4%多聚甲醛固定，OCT包埋剂包埋以及冰冻切片后(每片30 μm)，进行ChAT免疫组织化学染色。一抗为抗ChAT抗体，(Millipore公司)，1∶500稀释；二抗为生物素标记的驴抗羊IgG(Invitrogen公司)1∶1000稀释。冰冻切片经PBS冲洗后，滴加3%过氧化氢去离子水室温孵育20 min；滴加一抗，4℃过夜；接下来滴加二抗，室温孵育10 min；然后用抗生物素蛋白-生物素复合物孵育30 min；二氨基联苯胺(3,3’-diaminobenzidine, DAB)显色后(每步中间均用0.3% PBST冲洗三次，每次5 min)苏木精复染；中性树胶封片；最后成片用ScanScope XT(Leica Biosystem)扫描，并用ImageScope(Leica Biosystem)截图。

1.2.6 ChAT阳性神经元计数

ChAT染色用于标记脊髓前角运动神经元。分别计数手术侧和手术对侧脊髓前角ChAT阳性神经细胞。每只动物分析了16张ChAT染色的切片。整个病理染色及后续数据分析采用双盲方式。

1.3 数据处理及统计分析

用GraphPad5 PRISM(GraphPad Software, Inco, San Diego, Calif., USA)统计软件进行分析，统计结果以“means±SEM”表示，差异显著性比较用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术后临床监测

术后未见动物死亡，大鼠恢复良好，未见异常临床症状。

2.2 SRA模型的建立

ChAT染色结果见图1。图1 A中，绿色点显示为ChAT染色阳性细胞。ChAT染色阳性细胞计数结果见图1B。与手术对侧相比，1周后在脊髓前角有20.06%的运动神经元细胞变性死亡，差异有显著性(P<0.05)。图1B中**P=0.0013。

2.3 用BDNF预防性给药结果

SRA手术后立即用BDNF进行预防性治疗，结果如图2、3所示。与对照组(PBS)相比，BDNF预防性给药组的ChAT染色阳性神经元显著增加(P<0.0001)；与对侧相比，百分率分别为17.85%，93.06%；说明BDNF对于运动神经元具有保护作用。该实验中，一共有6只大鼠的样品没有用于最后的数据分析，原因是其中有1只大鼠取材时发现手术周围和脊髓有炎症，4只大鼠部分染色切片损坏，1只大鼠植入微型渗透泵失败。

注： A. 脊髓的ChAT染色，绿色点显示为ChAT染色阳性细胞，bar=200 μm；B.脊髓切片ChAT 染色阳性细胞结果分析。**P=0.0013。图1 SRA手术1周后脊髓的ChAT染色阳性细胞计数(A)及结果分析(B)Note. A: ChAT stained section of the spinal cord. ChAT positive cells were labeled green dots, scale bar in the figure 1 A=200 μm. B: Data analysis of the number of ChAT positive cells in the spinal cord tissue at one week after surgery. **P=0.0013.Fig.1 Number of ChAT positive cells (A) and data analysis (B) of the spinal cord tissues at one week after spinal root avulsion surgery

图3 PBS或 BDNF预防性治疗2周后ChAT 染色阳性细胞结果分析Fig.3 Data analysis of ChAT positive neurons (% of ipsilateral side/controlateral side) in the spinal tissues of PBS and BDNF preventive treatment group at 2 weeks after surgery

2.4 用BDNF治疗性给药结果

SRA手术后1周后再用PBS或BDNF进行治疗性给药2周。结果如图4和图5所示，与对照组(PBS)相比， BDNF治疗给药组的ChAT染色阳性神经元细胞显著增加(P<0.0001)，与对侧相比，百分率分别为26.94%，86.87%；说明BDNF对运动神经元具有很强的保护作用。该实验手术中2只动物因麻醉死亡未计入结果统计。

注：A、C.对照组(PBS)；B、D. BDNF预防性给药组；A、B中bar=500 μm；C、D中bar=200 μm。图4 PBS或 BDNF治疗性给药2周后脊髓的ChAT 染色Note. A & C: PBS control group. B & D: BDNF treatment group. Scale bars in A and B=500 μm. Scale bars in C and D=200 μm.Fig.4 Histological changes of spinal cord tissues of the PBS or BDNFc treatment groups at 2 weeks after surgery(ChAT staining)

图5 PBS或 BDNF治疗性给药2周后ChAT 染色结果分析Fig.5 Data analysis of ChAT positive neurons (% of surgery side/contralateral side) in the PBS and BDNF treatment groups at 2 weeks after surgery

3 讨论及应用

目前ALS作为运动神经元疾病的一种，尚未有完全治愈的药物，又因其病程发展迅速，使患者丧失了最基本的生活能力，给病人带来了极大的痛苦，给家庭和社会都带来沉重的负担[2-3，20]。根据不同的假说，科学家们建立了多种ALS动物模型，如：神经微丝基因动物模型，神经毒性动物模型，免疫介导动物模型，而且随着基因组学的发展，还成功构建了基因突变动物模型如：SOD1基因突变模型，TDP-43基因突变模型，Wobbler基因突变模型等，来研究ALS的发病机制及治疗措施[21]。今年中国科学家还成构建了猪的SOD1基因突变模型为揭示ALS疾病机理和开发治疗药物提供了新的动物模式[22]。本研究主要是建立了通过轴索外手术牵拉第4腰椎腹侧神经根来直接导致脊髓前角运动神经元变性死亡来模拟ALS疾病的一种动物模型。

本研究发现，大鼠手术后恢复良好，临床观察无异常。ChAT染色结果说明牵拉后造成明显的运动神经元变性死亡。随后我们又研究用BDNF治疗SRA动物，发现不管是预防性给药还是术后1周后再进行治疗性给药都达到了良好的治疗效果，ChAT染色阳性神经元细胞均显著增加(P<0.0001)，结果分别为17.85% 比93.06%；26.94% 比86.87%。

综上所述，SRA动物模型为轴索外手术模型，由于无需打开脊柱，操作简便，能显著的引起脊髓前角运动神经元的变性死亡，且用BDNF治疗后能有效保护运动神经元，可重复性强，为揭示ALS疾病机理和开发治疗药物提供了有价值的动物模式。

【致谢】高巍、郑春艳、郭建军、金诗怡为本实验提供了实验技术支持，徐燕梅博士为本实验提供了统计学分析,在此深表感谢。

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