MiR-31转基因小鼠的构建及其在组织器官的表达

付明阳，王春芳，李宵，田峰，张永涛，李鹏飞， 陈朝阳，刘芳，景志杰，张引红

(山西医科大学实验动物中心；实验动物与人类疾病动物模型山西省重点实验室，太原 030001)

Conflict of interest statement: We declare that we have no conflict of interest statement.

脊髓损伤是一种严重致残性神经系统疾病，如何重塑和恢复脊神经功能一直是治疗脊髓损伤的关键问题。近几年，随着有关细胞治疗的研究不断发展，干细胞治疗成为研究热点。Cusimano等[1]研究表明，在脊髓损伤处注射神经干细胞可以改善脊髓损伤后的微环境并能重塑受损轴突。本课题组之前同样证实注射神经干细胞对脊髓损伤的修复起促进作用，可以一定程度上恢复截瘫小鼠的运动功能[2]。神经干细胞是一种具有自我更新、多分化潜能的细胞，其可分化为神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞[3]。神经干细胞因具有细胞同源性特征，在细胞移植治疗脊髓损伤方面具有很大的优势。虽然神经干细胞移植治疗脊髓损伤已经取得了很大的进展，但如何增强其增殖能力和较多的定向分化为具有功能的神经细胞，一直是亟待解决的问题。

MicroRNA是一种小分子RNA，不编码蛋白质，可以通过与靶基因的特异性结合，使其降解或抑制其转录，从而负性调节蛋白的表达。在前期的实验中，本实验组使用TLDA技术进行神经干细胞与运动神经元的microRNA表达谱的检测，发现miR-31在运动神经元低表达而在神经干细胞中高表达，查阅文献时发现miR-31在胚胎干细胞中特异性表达[4]。因此，我们认为miR-31可能在神经干细胞维持未分化状态及诱发内源性神经干细胞增殖中发挥重要作用。随后，我们在体外神经干细胞培养时通过转染miR-31 mimic及miR-31 inhibitor，证实miR-31过表达可以使神经干细胞维持未分化状态，抑制其表达分化的比例增多[5]。

本课题组一直致力于小鼠脊髓损伤修复中miR-31对内源性神经干细胞的调控作用的研究，为了更好的研究内在过表达的miR-31对神经系统的影响，进而研究内在过表达的mi-31对脊髓损伤等神经系统疾病的调控作用。在此基础上我们使用Gateway Technology技术构建了miR-31过表达载体，通过显微注射技术构建了miR-31过表达转基因小鼠，希望借助此小鼠研究内在过表达的miR-31对机体所产生的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

3～4月龄清洁级FVB小鼠60只，雌雄比为2∶1，体重25～30 g，购于山西医科大学实验动物中心【SCXK(晋)2015-0001】，饲养于山西医科大学实验动物中心屏障环境中【SYXK(晋)2015-0001】。饲养期间给予小鼠标准饲料及洁净饮用水(均由山西医科大学实验动物中心提供)。饲养环境：昼夜各半交替，湿度恒定，温度20～25℃。所有操作均符合实验动物伦理学要求(伦理审批号：IACUC2017-002)。

1.1.2 实验试剂

Gateway BP Clonase II Enzyme Mix(invitrogen，11789-020)，Gateway LR Clonase II Plus Enzyme Mix(invitrogen，12538-120)，QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen，28704)，质粒提取试剂盒(Tiangen，DP103-02)，miRNA Isolation Kit (Ambion,1309105)，TaqMan MicroRNA Assays(ABI)，TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 5.0(TaKaRa)，Anti-Nestin抗体(Abcom，ab134017)，兔Anti-Chicken IgY(Abcom，ab6749)。

1.1.3 实验仪器

荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 7300)，电泳仪(Consort E815)，水平电泳槽(SCIE PLAS)，UV transilluminator(UVP， M-26)，小型离心机(Thermo Pico17)，电热恒温干燥箱(广州东方电热干燥设备厂)，恒温水浴锅(Hengao， HWT-6B)，全温空气摇床(上海福玛实验设备有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 载体的构建

(1)利用重叠PCR扩增attB1-miR31-attB2。引物序列为5’-3’，attB1-Kozak-miR31：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTGCCACCGAAAA TGGCTGTATTCATCGTTG，attB2-miR31：GGGGAC CACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGACAAGTCAGAGC AGGGTCAT。扩增程序：98℃ 3 min；98℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 60 s、30个循环；72℃ 5 min。 经PCR扩增随后进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果后回收-20℃保存。

(2)利用Gateway clone构建pDown-miR31。将扩增好的attB1-miR31-attB2进行BP反应，25℃，3 h。反应结束后将BP产物转化到大肠杆菌Stbl3中，冰上孵育30 min，42℃热击细胞90 s，立即转移到冰上孵育2 min，加入300 μL S.O.C. medium，在37℃、225 RPM的摇床里孵育1 h，随后把100 μL转化物涂到含有50 μg/mL Kan的LB平板上，37℃孵育过夜后即可用于筛选。扩增程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 1 min、29个循环；72℃ 1 min。经PCR扩增随后进行琼脂糖凝胶电泳验证，筛选阳性质粒。

(3)利用Gateway cloning构建PRP.Ex2d-EF1A>miR31。随后提取质粒pDown-miR31和PRP.Des2d进行LR反应，25℃，3 h。反应结束后将LR产物转化到Stbl3中。PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳验证，筛选阳性质粒。随后进行载体构建。

1.2.2 miR-31转基因小鼠的制作

制备假孕母鼠和正常怀孕小鼠，从正常受孕母鼠体内取出受精卵，使用DNA显微注射法将构建好的miR-31过表达载体注入受精卵原核，然后转移至假孕母鼠的输卵管内，待其自然产下新生鼠。

1.2.3 miR-31转基因小鼠的鉴定

待小鼠出生4周后，剪取0.5～1 cm鼠尾，提取鼠尾DNA，经PCR扩增。鉴定引物F：ATGTAGGGCCCTGTGACTTG，R：GCTGGGCACATGTAAGGTTT。反应步骤：DEPC水22 μL、DNA 2 μL、引物1 μL、PremixTaq(2×)25 μL，反应体系50 μL。反应程序：94℃ 30 s；59℃ 30 s；72℃ 40 s，30个循环。随后进行琼脂糖凝胶电泳，观察结果鉴定阳性小鼠。

1.2.4 miR-31转基因小鼠的繁殖及观察

将鉴定为阳性的小鼠配种繁殖，并将子代中的阳性小鼠继续交叉配种繁殖。全部过程均在屏障环境中进行，期间送检微生物和寄生虫。在小鼠饲养过程中，对小鼠的产仔、阳性率、基本数据等进行观察记录。

1.2.5 miR-31转基因小鼠各组织miR-31的表达情况

剪取阳性小鼠和野生型小鼠的心脏、肝、肺、肾、脑、脊髓、背部皮肤100 mg左右，提取microRNA，随后进行RT-qPCR检测以上各组织中miR-31的表达变化情况。对照组为野生型小鼠，U6为内参基因。成熟miR-31序列：AGGCAAGAUGCUGGCAUAGCUG。RT反应步骤：100 nmol/L dNTP 0.15 μL、Multiscribe Reverse Transcriptase 1 μL、10× Reverse Transcription Buffer 1.5 μL、RNase Inhibitor 0.19 μL、Nuclease-free water 4.16 μL、RNA 5 μL、5×Rtprimer 3 μL，反应体系：15 μL。反应程序：16℃ 30 min、42℃ 30 min、85℃ 5 min。荧光定量PCR反应步骤：Taqman Small RNA Assay 1 μL、cDNA 1.33 μL、Taqman Universal PCR Master Mix 10 μL、Nuclease-free water 7.67 μL，反应体系：20 μL。反应程序：50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，后两个循环重复40次。

1.2.6 miR-31转基因小鼠神经系统内Nestin的表达情况

从miR-31转基因小鼠和野生型小鼠的脑和脊髓取材100 mg左右，使用Trizol按照常规步骤提取mRNA，反转录后荧光定量PCR检测Nestin的表达情况，β-actin作为内参基因。Nestin引物序列F：GGTCACTGTCGCCGCTACTC，R： AAGCGGACGTGGAGCACTA。 β-actin引物序列F：TCACCGGAACGGAGCTATG，R：GAAGCGTTCATTCCCAATGG。RT反应步骤：RNA 1 μL、oligo(dt)Primer 1 μL、Rnase free water 4 μL，70℃ 10 min后冰上急冷2 min以上。模板引物变性溶液6 μL、5× M-MLV 2 μL、dNTP Mix 0.5 μL、Rnase Inhibitor 0.25 μL、Reverse M-MLV 0.25 μL、Rnase free water 1 μL，反应体系：10 μL。反应程序：42℃ 1 h、70℃ 15 min。荧光定量PCR反应步骤：SBRY Green 10 μL、引物0.6 μL、cDNA 1 μL、Rnase free water 8.4 μL，反应体系：20 μL。反应程序：50℃ 2 min、95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 1 min，后两个循环重复40次。

将miR-31转基因小鼠和野生型小鼠灌注后，取出脑和脊髓的胸椎段，4%多聚甲醛固定，常规步骤脱水包埋。切片脱蜡后进行抗原修复， Nestin一抗4℃过夜孵育，清洗后二抗室温孵育2 h，Hoechst复染后荧光显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 载体的构建

扩增的attB1-miR31-attB2为722 bp，通过琼脂糖凝胶电泳,可以观察到在700 bp左右出现条带，说明扩增成功(图1 A)。构建的pDown-miR-31的PCR产物大小为956 bp，通过琼脂糖凝胶电泳，可以观察到在1000 bp左右出现条带，说明构建成功(图1B)。构建的PRP.Ex2d-EF1A>miR31的PCR产物大小为822 bp，通过琼脂糖凝胶电泳,可以观察到在750 bp左右出现条带，说明载体构建成功(图1C)。miR-31载体结构图谱(图1D)。

注：A. PCR扩增attB1-miR31-attB2产物琼脂糖凝胶电泳图Lane1～4:attB1-miR31-attB2；B. 菌落PCR筛选pDown-miR31, Lane1～Lane4: pDown- miR31；C. 菌落PCR筛选PRP.Ex2d-EF1A>miR31, Lane1-Lane10: PRP.Ex2d-EF1A>miR31；D. 载体结构图谱。图1 miR-31载体构建过程Note. A. Agarose gel electrophoresis of PCR amplified attB1-miR31-attB2 products. Lanes 1-4: attB1-miR31-attB2. B. Filtration of pDown-miR31 colony, Lanes 1-4: pDown- miR31.C.Filtration of PRP.Ex2d-EF1A>miR31 colony, Lanes 1-10: PRP.Ex2d-EF1A>miR31. D. Construction of miR-31 overexpression vector.Fig.1 Construction of the miR-31 overexpressing vector

2.2 miR-31转基因小鼠的制作与鉴定

首批共构建miR-31转基因小鼠55只，其中经鉴定阳性小鼠共4只，雄鼠1只，雌鼠3只。在屏障环境中饲养3年，共繁殖超过14代，经鉴定阳性小鼠超过300只。鼠尾DNA荧光定量PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳检测，在200 bp左右出现条带，与miR-31引物大小212 bp相符。(图2)

注：Lane1、2、4、5、7：miR-31转基因阳性小鼠，Lane3、6：miR-31转基因阴性小鼠。图2 PCR扩增miR-31产物琼脂糖凝胶电泳图Note. Lane1,2,4,5,7: miR-31 positive transgenic mice. Lanes 3,6: miR-31 negative transgenic mice.Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the PCR amplified miR-31 products

2.3 miR-31转基因小鼠的繁殖及观察

小鼠饲养于屏障环境中(微生物与寄生虫检验报告登记编号：2015071)，在饲养小鼠的过程中对其进行观察记录，发现阳性转基因小鼠每胎产仔10～15只，与野生型小鼠并无明显差别。在7～10代时，出现阳性小鼠繁殖的禁锢期，每代仅有2～3窝，其余小鼠合笼后不交配；当繁殖超过10代时，小鼠重新开始大量繁殖，需要限定繁殖。繁育初期，每胎阳性率为40%～50%；随着小鼠代数的增加，阳性率呈上升趋势，总阳性率超过80%，并有个别小鼠后代为全阳性。miR-31转基因小鼠(miR-31 transgenic mice)与普通FVB小鼠(野生型小鼠，wild type mice，WT)基本数据如表1，可以看出miR-31转基因小鼠与普通FVB小鼠身长和体重对比，其差异无显著性(P>0.05)。这就可以说明miR-31过表达载体的转入对小鼠生长并无影响。

表1 miR-31转基因小鼠与野生型小鼠身长、体重对比Tab.1 Comparison of the body length and weight of miR-31 TG mice and wild type mice (±s,n=10)

注：与野生型小鼠比较，P>0.05。

Note. Compared with the wild type mice，P>0.05。

2.4 miR-31转基因小鼠部分组织器官的miR-31表达情况

通过荧光定量PCR检测，发现miR-31转基因小鼠的各主要组织器官miR-31的表达较野生型小鼠明显升高，差异有显著性(P<0.05)。(图3)

注：心脏、肝、肺、肾、脑、脊髓、皮肤组织器官miR-31的表达均升高，心脏2.883倍，肝2.941倍，肺3.153倍，肾2.170倍，脑2.580倍，脊髓1.932倍，皮肤2.954倍。P<0.05。图3 WT与miR-31TG荧光定量PCR结果对比Note. All tissues and organs were increased: heart 2.883, liver 2.941, lung 3.153, kidney 2.170, brain 2.580, spinal cord 1.932, skin 2.954. P<0.05.Fig.3 Comparison of the real-time PCR results of WT and miR-31TG mice

2.5 miR-31转基因小鼠和野生型小鼠的Nestin表达情况

从荧光定量PCR的结果中可以看出，miR-31转基因小鼠脊髓Nestin的表达量为3.985，脑Nestin的表达量为4.383，均高于野生型小鼠，表达差异有显著性(n=6，P<0.05)。免疫荧光照片显示，Hoechst对细胞核染色，图中蓝色荧光部位即为细胞核，绿色荧光部位为Nestin抗原阳性细胞，即为神经干细胞。在miR-31转基因小鼠的脑和脊髓中，Nestin阳性表达细胞数量显著高于野生型小鼠(n=9，P<0.05)。因此，在miR-31阳性小鼠的脑和脊髓中，神经干细胞的数量多于野生型小鼠。(图4)

3 讨论

注：A.miR-31TG和WT小鼠脑和脊髓Nestin荧光定量PCR结果，P<0.05；B1. 野生小鼠脊髓组织Hoechst和Nestin免疫荧光；B2. 野生小鼠脑组织Hoechst和Nestin免疫荧光；B3. miR-31转基因小鼠脊髓组织Hoechst和Nestin免疫荧光；B4. miR-31转基因小鼠脑组织Hoechst和Nestin免疫荧光；C1. 脊髓Nestin阳性细胞百分比对比，P<0.05；C2. 脑Nestin阳性细胞百分比对比，P<0.05。图4 野生小鼠和miR-31转基因小鼠Nestin荧光定量PCR结果、Hoechst和Nestin免疫荧光(×40)、Nestin阳性细胞百分比对比Note. A. PCR of brain and spinal cord in the miR-31TG and WT mice, P<0.05.B1. Hoechst and Nestin immunofluorescence stained spinal cord tissue in the wild type mice. B2. Hoechst and Nestin immunofluorescence staining of the brain tissue in wild type mice. B3. Hoechst and Nestin immunofluorescence staining of the spinal cord tissue in miR-31TG mice. B4. Hoechst and Nestin immunofluorescencestaining of the brain tissue in miR-31TG mice. C1. Percentage of nestin positive cells in the spinal cord tissue, P<0.05. C2. Percentage of nestin positive cells in the brain tissue, P<0.05.Fig.4 PCR，Hoechst and Nestin immunofluorescence staining and percentage of nestin positive cells in the wild type mice and miR-31 transgenic mice

MicroRNA(miRNA)是一种保守的小分子非编码调控RNA，可在动物细胞中介导转录抑制或诱导它们的靶mRNA降解。一个miRNA可以有多个靶基因，同样一个mRNA也可以有多个调控它的miRNA。MiR-31在胚胎早期发育过程中高表达，并在许多生物发育过程中发挥重要作用。包括生殖发育、胚胎植入、骨骼形成和肌发生等，并与免疫系统相关。多项研究表明，miR-31与多种生理病理过程相关。在肿瘤方面，miR-31在不同肿瘤组织中的表达有明显的差异，其在结、直肠癌、肝癌、肺癌等癌组织中呈现高表达[6-8]。而最近研究表明，过表达的miR-31可显著抑制肺腺癌肿瘤干细胞的增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞调亡[9]，这说明人们以往对于miR-31的过表达与肿瘤之间的关系并不是很明确，在某些肿瘤的发生发展过程中，miR-31的过表达并不是引起或加重肿瘤的原因，而是机体对肿瘤的发生发展而自发形成的一种保护机制，这也能够提示我们miR-31的过表达在抑制某些肿瘤方面能够发挥非常重要的作用，为临床治疗肿瘤提供新的策略和方向。在心血管系统方面，Ji等[10]通过基因芯片分析表明在成年大鼠血管壁的平滑肌细胞中miR-31的含量十分丰富。杨四宝等[11]在研究心肌梗死后心力衰竭中miRNAs的功能时发现miR-31的表达水平显著升高，并且心功能恶化程度越高其表达水平越高，呈正相关趋势，这样可以看出miR-31在心肌梗死后心衰的进程中起到重要作用。因此，在心肌梗死后心衰的治疗方面，可以尝试调控miR-31从而达到治疗目的，这也是一种新的治疗思路。在神经系统方面，本课题组先前实验证实miR-31参与了脊髓损伤后内源性NSCs的激活、募集和促进其定向分化为神经元的作用，还可以调控脊髓损伤的炎症微环境[12]。我们在对神经干细胞和运动神经元的miRNAs对比时发现，miR-31的表达差异性比较明显，所以我们希望通过调控miR-31在神经干细胞的表达来研究其在神经干细胞中所发挥的作用。这样可以为改善脊髓损伤后的炎症微环境提供新的策略，可以更好的重塑受损神经，为临床有效治疗脊髓损伤提供理论和实验依据。

我们构建的miR-31过表达转基因小鼠，其在心脏、肝、肺、肾、脑、脊髓、皮肤的表达升高且稳定，这样我们可以研究内在过表达miR-31的调控功能。通过荧光定量PCR结果显示，在脊髓和脑组织中miR-31表达升高1.9倍和2.5倍。基于miR-31对神经干细胞的调控作用，在脊髓和脑组织中nestin的表达均升高显著，分别升高3.9倍和4.3倍。Nestin作为神经干细胞的特异性标志物，有提示神经干细胞自我更新和维持多向分化潜能的作用，它的升高说明miR-31转基因小鼠神经系统内神经干细胞的自我更新能力和维持干性能力强。通过免疫荧光实验Hoechst细胞核染色和标记蛋白Nestin荧光图片可以看出，miR-31转基因小鼠神经系统内神经干细胞的数量明显多于野生型小鼠，与荧光定量PCR结果一致。这也能够证明miR-31过表达利于神经干细胞干性的维持、增殖等。因此，我们可以利用miR-31转基因小鼠研究内在过表达的miR-31对神经系统的影响，进而研究内在过表达的mi-31对脊髓损伤等神经系统疾病的调控作用。

虽然脊髓损伤后通过移植神经干细胞修复受损的神经细胞在动物模型中有一定的治疗作用，但目前神经干细胞分化为神经元的比例较低及内源神经干细胞得不到募集。因此，如何动员内源性神经干细胞使其数量增加，同时提高神经干细胞分化为神经细胞的比例，是移植治疗过程中的关键问题。目前，miRNA在脊髓损伤中的调控作用已经得到人们的广泛关注。生物信息学分析表明，异常表达的miRNA可对脊髓损伤过程中神经的重塑、炎症微环境、氧化应激等产生重要影响。因此，针对miRNA的研究可能为脊髓损伤的治疗提供新的方向。结合神经干细胞对脊髓损伤后的修复作用和miR-31对神经干细胞的调控作用。可在脊髓损伤处注射内在过表达miR-31的神经干细胞，观察其疗效并研究其作用机制，这也是本课题组利用miR-31转基因小鼠进一步研究脊髓损伤的方向。不仅如此，过表达的miR-31参与多种疾病的发生发展。Xu等[13]证实在银屑病中miR-31过表达，因此，我们可以利用miR-31转基因小鼠研究内在过表达的miR-31在银屑病的发生发展中起到的作用。因此，miR-31转基因小鼠不仅可以用于研究神经系统的疾病，如脊髓损伤、阿尔兹海默、帕金森等，还可作为研究其他有关miR-31过表达疾病的工具鼠，为研究miR-31过表达在体内的功能提供便捷、稳定的工具鼠。

References)

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