丙氨酰-谷氨酰胺缓解Diquat诱导的断奶仔猪氧化损伤的影响

辛向荣 叶亚玲 游金明 贺 琴 邓宸玺

(江西农业大学，江西省动物营养重点实验室，江西省营养饲料开发工程中心，南昌 330045)

动物在正常的生理条件下，机体内氧化和还原水平处于动态平衡中，即自由基不断产生，同时又被及时清除。如果这种稳态被打破，体内自由基将因无法及时分解或转化而出现大量累积。当自由基超过机体抗氧化防御系统的承受能力时，将造成机体氧化损伤，进而造成动物消化系统和免疫系统受损，生产性能下降[1]。在养猪生产中，氧化应激是断奶仔猪常见的生理现象，也是引起养殖经济损失的一个主要因素。研究表明，谷氨酰胺(Gln)是哺乳动物血液中最丰富的一种游离氨基酸，在泌乳21 d的母猪乳汁中含量高达1.93 mmol/L[2]。Gln作为重要的免疫增强因子，可减少氧化应激状态下的氧化损伤。研究发现，饲粮添加Gln可提高仔猪血浆和空肠组织中游离Gln、谷胱甘肽(GSH)含量。Gln可以缓解断奶应激引起的肠道Gln含量降低及氧化型谷胱甘肽(GSSG)/还原型GSH的比值增加[3]；还可以减少疾病或应激状态下细胞凋亡，主要通过增强抗氧化酶防御作用、热休克蛋白的表达以及诱导细胞自噬来发挥作用[4]。Gln作为小肠细胞的主要能量来源，也可有效促进小肠上皮细胞和淋巴细胞增殖、分化，修复小肠黏膜[5]。但由于Gln单体水溶性低、热不稳定，且易分解为有毒的焦谷氨酸和氨，因而大大限制了它在畜禽饲粮中的应用。二肽形式的Gln[Gln二肽，如丙氨酰-谷氨酰胺(Ala-Gln)]则可克服单体Gln的缺点，在水溶液、热环境下较稳定，常温下保存2年仍保持稳定，且在水中溶解度约为单体Gln的4倍[6]。小肠黏膜可吸收Gln二肽，在组织和细胞内快速分解成Gln而被利用，小肠对Gln二肽吸收具有不饱和性，且不存在竞争，相比单体Gln具有更大的吸收利用优势。因此Gln二肽作为Gln的替代物广泛应用于临床医学的全胃肠外营养。然而，目前Gln二肽对断奶仔猪抗氧化能力的影响鲜有报道。因此，本研究拟以Ala-Gln为试验材料，探讨Ala-Gln对Diquat诱导的氧化应激仔猪血清、空肠和肝脏抗氧化指标的影响，旨在为Ala-Gln在仔猪饲粮中的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验所用的Ala-Gln购自上海超强化工有限公司，纯度≥99%。

1.2 试验动物与试验设计

试验采用双因子设计，选取24头健康状况良好、胎次相近的21日龄断奶去势小公猪，随机分成2个组，每组12个重复，每个重复1头猪，2个组分别饲喂基础饲粮和基础饲粮+0.3% Ala-Gln的试验饲粮。预饲喂7 d后，在前期饲喂基础上，将仔猪分成4个组，每组6个重复，每个重复1头猪，分别为基础饲粮组、基础饲粮+0.3% Ala-Gln组、基础饲粮应激组、基础饲粮+0.3% Ala-Gln应激组。应激组通过腹腔注射8 mg/kg BW Diquat模拟仔猪氧化应激，未应激组则注射等量的灭菌生理盐水。Diquat剂量的确定参照徐静等[7]的方法。试验期7 d。

1.3 试验饲粮

试验所用基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，试验饲粮在基础饲粮中添加0.3%的Ala-Gln。饲粮配方参照NRC(2012)，以真回肠可消化氨基酸为基础进行配制。基础饲粮组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kilogram of the diet：Fe 120 mg，Cu 7 mg，Mn 25 mg，Zn 130 mg，I 0.2 mg，Se 0.3 mg，Co 1.5 mg，VA 4 800 IU，VD3480 IU，VE 40 IU，VK31.5 mg，VB13 mg，VB28 mg，VB63.5 mg，VB120.04 mg，泛酸 pantothenic acid 25 mg，尼克酸 niacin 35 mg，生物素 biotin0.15 mg，叶酸 folic acid 1 mg。

1.4 饲养管理

试验于江西农业大学江西省动物营养重点实验室动物试验中心保育猪舍进行。舍温控制在23～26 ℃，相对湿度保持在55%～65%，粉料饲喂，自由采食、饮水。驱虫、去势、防疫注射等管理措施按猪场常规程序执行。

1.5 样品采集与处理

于试验期第7天早上，以重复为单位，仔猪空腹前腔静脉采血。静置待凝血后，3 000 r/min离心15 min，分装血清，于-20 ℃保存待测。仔猪静脉注射5%戊巴比妥钠麻醉后，放血、剖开腹腔。迅速分离肝脏、空肠，剔除脂肪和可见结缔组织后，用预冷(4 ℃)生理盐水冲洗，迅速取样。肝脏迅速放入液氮，于-70 ℃保存待测。

将小肠和肠系膜推向左下方，暴露出十二指肠腹膜固定段，在此用线结扎定位空肠头部位，剪断分离肠系膜，取空肠中部10 cm左右，用预冷生理盐水轻轻冲净肠内壁，剪取2 cm存于1.5 mL冻存管中，液氮速冻，于-70 ℃保存待测。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 血清抗氧化指标

采用南京建成生物工程研究所试剂盒，根据试剂盒说明要求进行检测，分别测定血清Gln、GSH、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)。

1.6.2 空肠、肝脏抗氧化指标

采用南京将建成生物工程研究所试剂盒，根据试剂盒说明要求进行检测，分别测定空肠、肝脏中GSH、MDA含量和GSH-Px、CAT、T-SOD活性以及T-AOC。

1.6.3 肝脏谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)、超氧化物歧化酶1(SOD1)mRNA表达量

1.6.3.1 总RNA提取与反转录

按试剂盒说明采用Trizol法提取肝脏总RNA。并测定RNA的浓度与纯度，吸光度(OD)260/280在1.8～2.2之间较为理想。利用TaKaRa RR047A反转录试剂盒进行反转录，合成第1链cDNA，置于-20 ℃保存待测。

1.6.3.2GPx4、SOD1 mRNA表达量检测

GPx4、SOD1 mRNA引物和探针采用Primer express 2.0软件设计，并由专门公司合成，引物和探针序列见表2。按下述反应条件在FTC2000(Canada)实时荧光定量PCR仪上进行反应，PCR反应体系为50 μL：25 μL 2×Hotstart Fluo-PCR mix，1 μL×2上、下游引物，0.5 μL Probe (25 pmol/μL)，1 μL cDNA模板，21.5 μL dH2O。荧光定量PCR扩增条件的设置：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s；60 ℃ 30 s循环40次。以β-肌动蛋白(β-actin)作为内参，采用2-ΔCt法计算GPx4、SOD1 mRNA表达量。

表2 GPx4、SOD1和β-actin mRNA的引物和探针序列

1.7 数据统计

采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析，试验指标按因子试验设计进行双因素有效互作方差分析，分析主效应(Ala-Gln和Diquat)以及两者的交互效应，Duncan氏法进行多重比较，结果以“平均值±标准误”形式表示。通过2-ΔCt法计算mRNA表达量，结果以“平均值±标准误”形式表示。P<0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响见表3。由表中数据可知，Diquat对血清GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC及MDA含量有显著影响(P<0.05)，但对血清Gln、GSH含量和CAT活性没有影响(P>0.05)；Ala-Gln对血清Gln、GSH含量和GSH-Px、T-SOD活性及T-AOC有显著影响(P<0.05)，但对血清MDA含量和CAT活性没有显著影响(P>0.05)；Diquat与Ala-Gln的交互效应对血清T-SOD活性和T-AOC有显著影响(P<0.01)，但对血清Gln、GSH、MDA含量和GSH-Px、CAT活性没有显著影响(P>0.05)。

多重比较发现，Diquat诱导氧化应激后，仔猪血清GSH含量、T-SOD活性显著下降(P<0.05)。仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著降低了血清T-SOD活性(P<0.05)，显著提高血清Gln含量和T-AOC(P<0.05)，对血清GSH含量和GSH-Px、CAT活性无显著影响(P>0.05)；仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著提高了血清Gln、GSH、MDA含量以及GSH-Px、T-SOD活性(P<0.05)。

表3 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

-表示未应激，+表示应激，Ala-Gln：丙氨酰-谷氨酰胺。同行数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同或无字母表示差异不显著(P>0.05)。下表同。

- mean no stress, + mean stress, Ala-Gln: anyl-glutamine. In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪空肠抗氧化指标的影响

Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪空肠抗氧化指标的影响见表4。由表中数据可知，Diquat对空肠GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量及T-AOC有显著影响(P<0.05)；Ala-Gln对空肠GSH-Px、T-SOD活性和MDA含量及T-AOC有显著影响(P<0.05)，但对空肠CAT活性无显著影响(P>0.05)；Diquat与Ala-Gln的交互效应对空肠MDA含量、GSH-Px活性和T-AOC有显著影响(P<0.05)，但对空肠CAT、T-SOD活性无显著影响(P>0.05)。

多重比较发现，Diquat诱导氧化应激后，仔猪空肠GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC显著下降(P<0.05)，空肠MDA含量显著上升(P<0.05)。仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著提高了空肠GSH-Px活性和T-AOC(P<0.05)，显著降低了空肠MDA含量(P<0.05)，但对空肠CAT和T-SOD活性无显著影响(P>0.05)；仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著提高了空肠GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC(P<0.05)，显著降低了空肠MDA含量(P<0.05)。

表4 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪空肠抗氧化指标的影响

2.3 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响

Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响见表5。由表中数据可知，Diquat对肝脏GSH-Px、CAT、T-SOD活性和MDA含量及T-AOC有显著影响(P<0.05)；Ala-Gln对肝脏T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量及T-AOC有显著影响(P<0.05)，但对肝脏CAT活性无显著影响(P>0.05)；Diquat与Ala-Gln的交互效应对肝脏MDA含量、GSH-Px活性以及T-AOC有显著影响(P<0.05)，但对肝脏CAT、T-SOD活性无显著影响(P>0.05)。

多重比较发现，Diquat诱导氧化应激后，仔猪肝脏GSH-Px、T-SOD活性和T-AOC显著下降(P<0.05)，肝脏MDA含量显著上升(P<0.05)。仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著提高了肝脏GSH-Px活性以及T-AOC(P<0.05)，显著降低了MDA含量(P<0.05)，但对肝脏CAT、T-SOD活性无显著影响(P>0.05)；仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln显著提高了肝脏GSH-Px、T-SOD活性及T-AOC(P<0.05)，显著降低了肝脏MDA含量(P<0.05)。

表5 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏抗氧化指标的影响

2.4 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏GPx4、SOD1 mRNA表达量的影响

Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏GPx4、SOD1 mRNA表达量的影响见表6。由表中数据可知，Diquat、Ala-Gln及Diquat与Ala-Gln的交互效应对肝脏GPx4、SOD1 mRNA表达量均有显著影响(P<0.05)。

仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln使肝脏GPx4 mRNA表达量提高了95.8%(P<0.05)；仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln使肝脏GPx4 mRNA表达量提高了166.7%(P<0.05)。

Diquat诱导氧化应激后，仔猪肝脏SOD1 mRNA表达量显著提高(P<0.05)。仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln使肝脏中SOD1 mRNA表达量降低了59.4%(P>0.05)；仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln使肝脏中SOD1 mRNA表达量降低了40.0%(P<0.05)。

表6 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏GPx4、SOD1 mRNA表达量的影响

3 讨 论

3.1 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

仔猪断奶后，食物从母乳到饲粮的转变，使采食量骤降，不能满足机体对Gln的需求。而Gln作为重要的抗氧化活性物质，外源性添加Gln，可有效改善仔猪生长性能，保护肠道形态结构，缓解仔猪断奶应激[3,8-12]。作为Gln的替代产品，Ala-Gln与Gln有相似的功能。在应激状态下，机体对Gln的需要量加大，内源性Gln不能满足机体的需求。且断奶后仔猪不能通过母乳获得Gln，断奶仔猪饲粮中添加Gln或Ala-Gln显得尤为重要[13]。动物体内抗氧化系统主要由GSH-Px、超氧化物歧化酶(SOD)、CAT和一些低分子化合物(维生素C、维生素E、GSH等)组成。其中血清抗氧化酶活性反映了动物机体内的氧化还原状态。饲粮中添加Gln也可有效防止机体由于前体物质不足而造成的GSH合成障碍[14]。

前期的试验研究发现，饲粮中添加0.3% Ala-Gln可显著提高21～28日龄仔猪生长性能[15]。本研究发现，仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln能够显著提高血清Gln含量，使得机体内Gln得到补充，有提高血清GSH含量及GSH-Px、CAT活性的趋势。这与戴定威等[16]研究结果相似。试验中还发现，血清T-SOD活性显著降低，这可能是因为机体处于氧化还原平衡状态，并不需要太多抗氧化酶就足够维持自身稳态。同样，张军民等[17]研究发现，试验组饲粮中添加1.2% Gln提高了35日龄仔猪血清GSH-Px活性，降低了血清SOD活性。而席鹏彬等[18]研究发现，通过向仔猪饲粮中添加Gln二肽，使断奶后血清SOD活性显著提高，这可能是由于添加物质规格和水平不同所导致。通过注射Diquat模拟氧化应激状态能够显著降低仔猪血清中GSH-Px、T-SOD活性，并显著降低血清T-AOC，且血清MDA含量显著升高。这正验证了当仔猪遭受持续的氧化应激时，血清GSH-Px、T-SOD活性的下降是为了调节机体内氧化和还原平衡。研究表明，动物体内抗氧化物酶活性的降低，是因为终产物过氧化氢(H2O2)的反馈调节作用或超氧阴离子(O2-)使抗氧化物酶灭活，徐静等[7]研究也发现，通过仔猪腹腔注射Diquat模拟氧化应激，显著或极显著降低了第7、14、21、28天血清GSH-Px、T-SOD活性，抑制羟自由基能力，显著提高了血清MDA含量，在第7、14、21、28天血清CAT活性有降低趋势，H2O2含量有增加趋势。

本试验研究发现，仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加0.3%的Ala-Gln可显著提高血清Gln、GSH含量，并能显著提高血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC，血清MDA含量有降低趋势。仔猪氧化应激状态下，机体为维持氧化和还原的动态平衡，需要提高抗氧化能力。而通过外源添加Ala-Gln能够提高血清中Gln含量，GSH-Px大量合成，同时SOD也持续发挥作用，T-AOC得到显著提高，缓解了氧化应激的强度，从而使仔猪免受应激伤害。

3.2 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪空肠、肝脏抗氧化指标的影响

小肠和肝脏作为动物体内最活跃的两大部位，能够为机体提供源源不断的营养素和免疫因子，同时在应激状态下也最容易受到损伤。小肠和肝脏组织中具有完善的抗氧化系统，抗氧化酶的表达和合成机制也非常完善。

仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln能够显著提高空肠GSH-Px活性，从而显著提高了T-AOC，空肠MDA含量显著下降，空肠T-SOD活性也有显著提高，这可能是由于仔猪肠道接触各种应激源，因此需要更强的抗氧化力来维持组织稳态。当仔猪遭受氧化应激时，仔猪的空肠GSH-Px、T-SOD和CAT活性显著下降，T-AOC显著下降，MDA含量显著提高。而Ala-Gln添加组的仔猪空肠GSH-Px、T-SOD活性显著提高，T-AOC显著提高，MDA含量显著降低。这表明Ala-Gln可以通过提高仔猪空肠抗氧化酶活性，增强抗氧化能力，减缓氧化应激危害。同时，仔猪饲粮中添加Aln-Gln也能够显著提高肝脏GSH-Px活性和T-AOC，显著降低MDA含量。氧化应激状态使仔猪肝脏GSH-Px、T-SOD活性显著下降，T-AOC和MDA含量显著上升，CAT活性显著下降，仔猪肝脏受到应激损伤。大量试验研究也发现，氧化应激能够降低仔猪肝脏SOD活性，提高MDA含量[19-21]。当饲粮中添加Ala-Gln时，能显著提高氧化应激状态下仔猪肝脏GSH-Px、CAT和T-SOD活性。这可能是由于外源性添加Ala-Gln后血清Gln含量增加，GSH-Px合成水平增加，保护组织细胞不受氧化损伤，CAT和T-SOD能够维持酶活性，正常发挥抗氧化作用。这也表明饲粮中添加Ala-Gln可以提高仔猪肝脏抗氧化能力。

3.3 Ala-Gln对氧化应激断奶仔猪肝脏GPx4、SOD1 mRNA表达量的影响

GSH-Px和SOD作为2种重要的抗氧化酶，在机体遭受持续氧化应激时，能够及时清除堆积自由基，维持氧化与还原动态平衡。GPx4是机体内抗氧化酶类GSH-Px家族中的重要成员，在不同组织中发挥重要的抗氧化功能[22]。GPx4是哺乳动物细胞中唯一能直接还原生物膜上的磷脂氢过氧化物，从而保护生物膜免受氧化应激损伤[23]。有研究表明，在仔猪肝脏中GPx4 mRNA表达量显著高于其他组织，SODmRNA表达量也相对较高[24]。

本试验研究发现，氧化应激状态断奶仔猪肝脏为维持氧化与抗氧化的动态平衡，提高了GPx4、SOD1 mRNA表达量，使肝脏抗氧化酶活性提高。外源性添加Ala-Gln后，正常生理状态下和应激状态下，GPx4 mRNA表达量都显著提高，而SOD1 mRNA表达量反而显著降低。这与Hiraishi等[25]研究结果一致，说明动物机体内整个抗氧化防御体系存在酶学机制反应，在正常、应激和病理状态下，动物机体的抗氧化能力维持相对恒定。同时Hiraishi等[25]研究表明，细胞在处于氧化应激状态下，SODmRNA的表达受超氧阴离子自由基的诱导。当Gln含量增加，GSH-PxmRNA表达量升高，组织内自由基得到及时清除，SOD的作用较少。通过荧光定量PCR结果进一步证实，添加Ala-Gln可以减少氧化应激产生的自由基，通过提高GSH-PxmRNA表达量，提高机体抗氧化能力。

4 结 论

① 仔猪正常生理状态下，饲粮中添加Ala-Gln可显著提高血清Gln含量和T-AOC，显著提高空肠和肝脏GSH-Px活性和T-AOC，显著降低空肠和肝脏MDA含量。

② 仔猪氧化应激状态下，饲粮中添加Ala-Gln可显著提高血清、空肠和肝脏的部分抗氧化指标，降低MDA含量，显著提高肝脏GPx4 mRNA表达量，显著降低SOD1 mRNA表达量。

③ 饲粮中添加Ala-Gln可减缓氧化应激对断奶仔猪机体组织的损伤，且在氧化应激状态下效果更为显著。

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