凝结芽孢杆菌微生态制剂对北京油鸡产蛋鸡抗脂质过氧化能力的影响

李嘉懿 郭 茜 张红星 谢远红 刘 慧* 连正兴

(1.北京农学院食品科学与工程学院，微生态制剂关键技术开发北京市工程实验室，食品质量与安全北京实验室，北京 102206；2.中国农业大学动物科技学院，北京 100193)

脂肪肝综合征(fatty liver syndrome，FLS)是由于肝脏内脂肪异常堆积代谢紊乱引起的一种代谢性疾病，常见于产蛋高峰期和后期蛋鸡[1-3]。Couch于1954年首次在美国西南部的产蛋鸡上首次发现FLS。FLS主要发生于笼养产蛋鸡，会导致产蛋鸡产蛋率明显下降，死亡率升高，给养殖业带来极大的经济损失。生产实践中发现，多数由于FLS死亡的母鸡，主要原因是肝脏脂肪积累过多，肝脏破裂导致出血和死亡。多数母鸡产蛋后或产蛋率达不到高峰时才被发现患有FLS，因此饲养过程中可以微生态制剂预防为主，以提高母鸡的抗氧化能力。徐鹏研究发现，地衣芽孢杆菌TS-01可以预防产蛋鸡FLS的发生；Pan等研究发现，饲粮中添加益生菌可以增加产蛋鸡血清谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性。目前有关凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)对北京产蛋油鸡FLS的预防及其抗脂质过氧化能力的研究尚未见国内外报道。因此，本文以北京油鸡为试验对象，通过在基础饲粮中添加冻干菌粉形式的凝结芽孢杆菌Liu-g1，研究其对产蛋鸡脂质过氧化特征指标丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和抗脂质过氧化特征指标及血清甘油三酯(triglycerides,TG)含量的影响，并通过观察肝脏组织切片油红O染色和测定肝脏粗脂肪含量，研究凝结芽孢杆菌Liu-g1对FLS的预防作用和抗氧化活性，旨在为开发具有抗氧化能力的凝结芽孢杆菌Liu-g1微生态制剂提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌株

凝结芽孢杆菌Liu-g1，筛选于传统干酪，经本课题组前期试验研究鉴定为产中性蛋白酶的菌株。

1.1.2 微生态制剂

于优化发酵条件下对凝结芽孢杆菌Liu-g1进行发酵，经离心浓缩和真空冷冻干燥，得到活菌数为7.35×1010CFU/g的冻干菌粉活菌制剂微生态制剂。

1.1.3 培养基

发酵培养基：大豆粕1.0%、玉米淀粉4.0%、碳酸钙0.6%。

平板计数琼脂(PCA)培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母浸粉2.5 g，葡萄糖1.0 g，琼脂17.0 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.4 仪器与设备

BT2202S电子天平(Electronic Balance，Sartorius公司，德国)、真空冷冻干燥机(Vacuum Freeze Dryer，Labconco公司，美国)、TGL-20M型高速台式冷冻离心机(High Speed Refrigerated Centrifuge，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)、202-001电热恒温干燥箱(Electrothermal Constant-Temperature Dry Box，北京科伟永兴仪器有限公司)。

1.2 试验设计与饲粮

选择120只体重差异不显著(P>0.05)、健康的14周龄北京油鸡产蛋鸡，随机分为空白对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4个组，每组3个重复，每个重复10只。空白对照组饲喂基础饲粮，试验组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)分别饲喂在基础饲粮中添加10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1的试验饲粮，使各试验组摄入活菌数量分别为108、109、1010CFU/kg。基础饲粮配制参考NRC(1994)标准，其组成及营养水平如表1所示。凝结芽孢杆菌Liu-g1微生态制剂由本实验室自制。试验用北京油鸡由北京市农林科学院畜牧兽医研究所提供，采用3层阶梯式笼养鸡舍，光照时间16 h，饲养温度20～23 ℃，人工喂料捡蛋，自由采食和采水，并按常规程序免疫。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)

1)预混料为每千克饲粮提供 The premix provided the following per kg of diets：VA 9 500 IU，VB11.5 mg，VB29.0 mg，VB63.0 mg，VB120.02 mg，VD32 375 IU，VE 19 IU，VK31.40 mg，生物素 biotin 0.95 mg，叶酸 folic acid 0.93 mg，D-泛酸钙D-pantothenic acid 9.3 mg，Cu (as copper sulfate) 15 mg，Fe (as ferrous sulfate) 60 mg，Mn (as manganese sulfate) 100 mg，Zn (as zinc sulfate) 70 mg，I (as potassium iodide) 0.50 mg，Se (as sodium selenite) 0.59 mg。

2)营养水平均为计算值。Nutrient levels were calculated values.

1.3 样品采集与指标测定

1.3.1 样品采集

血清采集：试验第10周，每组按重复取10只鸡用无菌注射器翅下静脉采血，每只采血2～3 mL，37 ℃凝血约2 h之后取出血清于2 mL离心管中，于4 000 r/min离心10 min，取上清液，-20 ℃冷冻保存备用。

肝脏组织：试验第10周，每组按重复随机宰杀5只油鸡，摘取肝脏并剪取1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm大小的肝脏分组浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定备用。

1.3.2 测定方法及指标

1.3.2.1 肝脏组织显微镜观察

肝脏组织油红O染色切片，显微镜下观察。

1.3.2.2 肝脏组织粗脂肪含量测定

取各组新鲜肝脏，分别冷冻干燥48 h，经过40目筛，称取2.00～5.00 g，全部移入滤纸筒内，依据GB/T 5009.6—003《食品中脂肪的测定》的方法[10]测定肝脏粗脂肪含量。

1.3.2.3 血清抗氧化指标测定

取1.3.1步骤冷冻的血清样品，送至北京中同蓝博临床检验所有限公司测定甘油三酯含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、GSH-Px活性、MDA含量。

1.4 数据统计分析

试验数据用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan氏法多重比较检验。试验数据用平均值±标准差表示，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清甘油三酯含量的影响

由图1可见，与空白对照组相比，10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清甘油三酯含量均显著下降(P<0.05)，分别降低了18.91%、57.55%、56.05%。100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清甘油三酯含量显著低于10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组(P<0.05)，且100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清甘油三酯含量最低。

2.2 肝脏组织油红O染色切片

经油红O染色后，肝脏细胞内脂肪滴呈红色，细胞核呈蓝色。由图2可见，空白对照组肝脏切片明显有大量的红色脂肪滴，而试验组肝脏组织切片中红色脂肪滴数量均明显少于空白对照组，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组几乎没有。这说明饲粮添加100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最好。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。图3同。

Value columns with different small letters mean significant difference (P<0.05), and with different capital letters mean significant difference (P<0.01). The same as Fig.3.

图1凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清甘油三酯含量的影响

Fig.1 Effects ofBacilluscoagulansLiu-g1 on serum triglyceride content of laying hens (n=10)

2.3 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡肝脏粗脂肪含量的影响

由图3可见，与空白对照组相比，10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组蛋鸡肝脏粗脂肪含量均极显著降低(P<0.01)，分别降低了56.45%、70.91%、66.78%。100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组肝脏粗脂肪含量极显著低于10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组(P<0.01)，降低了33.20%。这进一步验证了未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1时肝脏可能有脂肪堆积现象，而试验组结果表明凝结芽孢杆菌Liu-g1可以显著改善这一现象，具有较强抑制脂肪肝的作用。其中，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最好。该结果与图2中肝脏组织油红O染色切片结果一致。

A：空白对照组；B：10 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组；C：100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组；D：1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组。

A: blank control group; B: 10 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group; C: 100 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group; D: 1 000 mg/kgBacilluscoagulansLiu-g1 group.

图2肝脏组织油红O染色切片

Fig.2 Liver tissue sections with oil red O staining (400×)

图3 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡肝脏粗脂肪含量的影响

2.4 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标的影响

由表2可知，与空白对照组相比，10、100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清T-AOC分别显著提高了19.81%、29.62%(P<0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清GSH-Px活性分别显著提高了39.15%、48.15%、40.21%(P<0.05)；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组血清SOD活性均有一定程度的提高(P>0.05)，分别提高了1.38%、6.64%、10.45%；10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组的血清MDA含量均有一定程度的降低(P>0.05)，分别降低了13.58%、20.79%、19.64%。这说明凝结芽孢杆菌Liu-g1具有较好的脂质抗氧化能力。其中，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组效果最佳。

3 讨 论

3.1 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清甘油三酯和肝脏粗脂肪含量的影响

甘油三酯是脂肪酸和甘油合成的脂肪分子[11]。血液中高水平的甘油三酯与动脉粥样硬化和心脏病有关[12-15]，同时也是引发脂肪肝的可能原因。蛋鸡脂肪合成主要在肝脏中进行[16]。研究表明，肝脏脂质合成和分泌之间的平衡是调节蛋鸡肝脏内脂肪沉积的关键[17]。产蛋前期，肝脏大量合成脂肪以满足蛋黄沉积脂质的需要，当合成脂肪的速度大于向外转运的速度时，过量的脂肪就会沉积到肝脏中，最后导致肝脏脂质代谢紊乱，严重者导致肝内出血而死亡[11]。若血清甘油三酯含量高，可导致肝脏摄入的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)过多，促使肝脏合成甘油三酯过多，进而可能导致肝脏脂质代谢紊乱和脂肪肝的形成[18]。曹友德等[19]研究了高脂血症、FFA和脂肪肝的相关性发现，高甘油三酯组高脂血症、脂肪肝发病率和FFA含量均显著高于正常血脂组，且脂肪肝组甘油三酯、FFA含量显著高于非脂肪肝组，因此甘油三酯含量高可能导致脂肪肝的形成。本试验选取北京油鸡产蛋鸡为研究对象，检测产蛋鸡血清甘油三酯的含量，结果发现未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1的空白对照组血清甘油三酯含量偏高，有可能形成脂肪肝；而试验组血清甘油三酯含量显著降低，说明该菌有可能抑制脂肪肝形成，但需要进一步通过测定肝脏脂肪含量和血清抗氧化指标，证明凝结芽孢杆菌Liu-g1具有预防脂肪肝的作用和抗氧化活性。由图2和图3可知，进一步通过测定肝脏粗脂肪含量和观察肝脏组织油红O染色切片，发现未饲喂凝结芽孢杆菌Liu-g1的空白对照组产蛋鸡肝脏组织中粗脂肪含量偏高，且油红O染色切片脂肪滴数量最多，且随着饲粮凝结芽孢杆菌Liu-g1添加水平的增加，肝脏组织中粗脂肪含量降低，同时油红O染色脂肪堆积现象明显减少。这说明凝结芽孢杆菌Liu-g1能调节肝脏脂质合成和分泌之间的平衡，显著改善肝脏脂肪堆积，有效抑制蛋鸡脂肪肝的形成。其抑制机理可能与凝结芽孢杆菌Liu-g1具有脂质抗氧化活性有关。

表2 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标影响

同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

In the same row, values with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

3.2 凝结芽孢杆菌Liu-g1对产蛋鸡血清抗氧化指标的影响

Day等[20]提出脂肪肝发病机制“二次打击”假说。该假说认为第一次打击即肝脏脂肪变性，第二次打击则是由氧化应激引发的脂质过氧化。研究表明，脂肪肝的形成与体内抗氧化系统损伤及脂质过氧化有关[21]。机体在能量代谢过程中发生氧化还原反应所产生的电子传递过程中，氧不可避免的会发生不完全还原反应而产生活性氧(reactive oxygen species,ROS)[22]。ROS可能会引发脂质过氧化，破坏DNA链，损伤生物膜和组织等[23]。正常情况下，机体可以通过抗氧化防御系统来保护自身免受ROS带来的伤害。其中，SOD和GSH-Px是机体抗氧化系统中重要的2种酶。SOD能有效将超氧阴离子转化为过氧化氢，然后通过GSH-Px降解成水[24-25]。抗氧化系统不能消除的过量ROS会攻击生物膜的不饱和脂肪酸，并引发脂质过氧化而产生氧化应激的标志性产物——MDA[26]。T-AOC表示清除机体过剩的ROS而使其在细胞内保持一定水平，其水平高低代表了机体的抗氧化能力[27]。

本试验研究表明，与空白对照组相比，100 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1组蛋鸡血清T-AOC显著提高，3个试验组血清GSH-Px活性均显著提高，血清SOD活性和MDA含量分别有一定程度的提高和降低。宫秀燕等[28]研究发现，凝结芽孢杆菌显著提高了肉鸡血清T-AOC，极显著提高了血清SOD活性，显著降低了血清MDA含量，并且显著提高了血清GSH-Px活性，这与本试验结果相似。Kodali等[29-30]从凝结芽孢杆菌RK-02发酵液中提取到了具有明显清除自由基和抗氧化活性的胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)；袁建锋等[31]筛选到1株芽孢杆菌，发现其产生的EPS具有强抗氧化活性，并且对脂质过氧化有抑制作用；梅秀明等[32]研究表明，乳酸菌EPS能极显著提高血清SOD活性，极显著降低血清MDA含量，说明EPS能够增强机体抗氧化能力；李景艳[33]体外试验表明，EPS能显著提高血清T-AOC、SOD活性，显著降低血清MDA含量，能清除自由基，增强抗氧化能力。本研究凝结芽孢杆菌Liu-g1提高蛋鸡脂质抗氧化能力是否由产生的EPS的作用，有待后期试验研究。

4 结 论

饲粮添加10、100、1 000 mg/kg凝结芽孢杆菌Liu-g1能降低蛋鸡血清甘油三酯含量，肝脏粗脂肪含量，并提高血清T-AOC、GSH-Px、SOD活性，降低血清MDA含量；综合考虑，凝结芽孢杆菌Liu-g1添加水平为100 mg/kg时效果最好。

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