核因子-κB抑制物激酶ε促进人脑胶质母细胞瘤恶性进展的实验研究

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(1. 郑州大学药学院，河南 郑州 450001; 2.河南省人民医院药学部，河南 郑州 450003； 3.天津医科大学总医院，天津 300070)

核因子-κB抑制物激酶ε(inhibitor of nuclear factor kappa B kinase subunit epsilon，IKKε) 是IKK家族成员，可以通过核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)通路调控肿瘤的侵袭和迁移能力[1]。研究[2-4]表明，IKKε在人脑胶质瘤中高表达，并与病理分级相关，抑制IKKε表达后，可显著降低胶质瘤的侵袭和迁移能力。但IKKε通过IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途径促进人脑胶质母细胞瘤恶性进展的相关研究尚未见报道。本研究在U87-MG细胞中分别调控IKKε及YAP1的表达水平，进而检测IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i的表达水平，以探究IKKε通过IKKε-YAP1-miR-Let-7b/i途径促进胶质母细胞瘤的恶性进展的可能机制。

1 材料与方法

1.1材料和试剂IKKε短发夹核糖核酸(short hairpin ribonucleic acid，shRNA)慢病毒序列为5′-GCATCATCGAACGGCTAAATA-3′，无义序列为5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTC-3′，由上海吉凯公司合成；YAP1小干扰RNA(small interfere ribonucleic acid，siRNA)由广州锐博公司设计合成；IKKε上游引物为5′-GAGAAGTTCGTCTCGGTCTATGG-3′,下游引物5′-TGCATGGTACAAGGTCACTCC-3′；YAP1上游引物为5′-TAGCCCTGCGTAGCCAGTTA-3′,下游引物5′-TCATGCTTAGTCCACTGTCTGT-3′；磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物为5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′；miR-Let-7b/i及U6反转录引物及PCR引物均由广州锐博公司设计合成；人脑胶质母细胞瘤细胞株U87-MG购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。DMEM培养基(美国Gibco公司)，RT-PCR定量检测试剂盒(美国Promega公司)，转染试剂Lipofectamine 3000 (美国Thermo Fisher Scientific公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或抗鼠二抗及小鼠抗GAPDH抗体(北京中杉金桥生物工程有限公司)，抗IKKε抗体、抗YAP1抗体(美国Cell Signaling Technology公司)。

1.2细胞培养、病毒转染和siRNA转染U87-MG细胞采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱培养。转染前以3×105个/孔种于6孔板内，加2 mL完全培养基，过夜。次日稀释病毒，按1 μL/孔IKKε shRNA慢病毒原液稀释至6 mL完全培养基中并添加终浓度为5 μg·mL-1的聚凝胺，移去孔中培养基，按1 mL/孔添加稀释后的病毒液，同时建立对照，培养箱继续培养过夜，24 h后移去病毒液，加入2 mL完全培养基，继续培养48 h以进行后续实验。细胞种于6孔板内，细胞密度至70%～80%时，采用Lipofectamine 3000转染试剂按照说明书进行YAP1 siRNA转染，同时建立对照。

1.3Westernblot检测IKKε与YAP1表达RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，冰浴90 V转膜90 min。室温封闭2 h，一抗(IKKε 11 000稀释，YAP1 11 000稀释，GAPDH 11 000稀释),4 ℃孵育过夜，次日室温复温1 h后，PBST洗5 min，3次，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h，PBST洗5 min，3次，将发光液加至聚偏氟乙烯膜上，曝光，凝胶成像系统采集图像。

1.4RT-PCR检测IKKε、YAP1及miR-Let-7i/b表达Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA，反转录为cDNA， RT-PCR扩增，以GAPDH、U6为参照。扩增体系20 μL，包括PCR buffer 10 μL，双蒸水7 μL，目的基因合成引物2 μL，cDNA 1 μL。反应条件为95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，55 ℃、40 s，共40个循环；72 ℃延伸5 min。PCR结果判定采用2-ΔΔCT法。实验结果以GAPDH为内参照，计算IKKε、YAP1 mRNA的相对表达水平;以U6为内参照，计算miR-Let-7i/b的相对表达水平。各组均设复孔3个，重复实验3次。

1.5Transwell实验检测细胞迁移、侵袭能力Transwell上室中加入13(基质胶DMEM)稀释的基质胶60 μL，37 ℃下30 min使其凝胶。下室加入600 μL含血清培养基。待检细胞用无血清培养基制成细胞悬液，上室中加入5×104个细胞，24 h后弃上室液体，质量分数4%多聚甲醛固定15 min，棉签擦去上室未过膜细胞，结晶紫染色10 s，倒置上室显微镜下观察成像。

2 结果

2.1转染IKKεshRNA对YAP1及miR-Let-7b/i表达的影响与对照组和无义序列组相比较，转染IKKε shRNA组IKKε蛋白及mRNA水平明显降低，YAP1蛋白水平明显降低，miR-Let-7b/i水平明显升高(P均<0.05)。见图1。

2.2YAP1抑制miR-let-7b/i表达与对照组和无义序列组相比较，转染YAP1 siRNA组YAP1蛋白及mRNA水平明显降低；miR-Let-7b/i水平明显升高(P均<0.05)。见图2。

2.3转染IKKεshRNA抑制细胞迁移和侵袭情况与对照组和无义序列组相比较，转染IKKε shRNA组穿过小室细胞数明显降低(P均<0.05)。见图3。

图1 U87-MG细胞转染IKKε shRNA慢病毒后IKKε、YAP1及miR-Let-7b/i水平变化

A、B：转染IKKε shRNA慢病毒后，IKKε蛋白及mRNA水平的变化；C、D：转染IKKε shRNA慢病毒后，YAP1蛋白及mRNA水平的变化；E、F：转染IKKε shRNA慢病毒后，miR-Let-7b/i表达水平的变化

图2 U87-MG细胞转染YAP1 siRNA后YAP1及miR-Let-7b/i水平变化

A、B：转染YAP1 siRNA后YAP1蛋白及mRNA水平的变化；C、D：转染YAP1 siRNA后，miR-Let-7b/i表达水平的变化

3 讨论

IKKε在胶质瘤中明显高表达，并与胶质瘤的病理分级有关[5]。IKKε可体外调控胶质瘤细胞的增值、迁移和侵袭，并在体内促进胶质瘤的形成[3, 5]。IKKε主要影响NF-κB等通路[6-10]。本实验发现IKKε能调控YAP1的表达，而YAP1是Hippo通路下游的重要因子,并且YAP1入核可促进胶质瘤的进展[11]。同时，实验发现敲低IKKε后YAP1的mRNA水平没有明显变化，而蛋白水平明显降低，说明IKKε调节YAP1不是在转录水平，而是在转录后的翻译修饰水平。

YAP1是重要的转录因子，主要通过Hippo通路发挥转录激活作用[12-13]。研究[14-17]表明，LIN28是一种RNA结合蛋白，可结合miR-Let-7家族前体的终端环，阻断其成熟，因此增强致癌性。Chaulk等[18]研究发现在乳腺癌中YAP1能通过调节LIN28-Let-7轴降低成熟Let-7的表达，但抑制YAP1的表达可降低LIN28的蛋白量，而其mRNA无明显改变，由此说明YAP1调控LIN28是通过转录后修饰。因此,YAP1调控miR-Let-7表达是在转录后，而不是在转录水平。本实验通过敲低YAP1后检测miR-Let-7b/i的变化证明了这个结论。

图3 Transwell实验结果

A、B：Transwell上室未加基质胶条件下，各组细胞穿膜情况(×200)，反映各组细胞迁移能力情况；C、D：Transwell上室加基质胶条件下，各组细胞穿膜情况(×200)，反映各组细胞侵袭能力情况

在多种类型肿瘤中，发现miR-Let-7家族是重要的肿瘤抑制因子，miR-Let-7能够通过多种通路抑制胶质瘤细胞系的增殖、迁移和侵袭。Johnson等[19]研究发现ras基因包括H-ras、K-ras和N-ras，在细胞进程中这些因子都受miR-Let-7负调控。Shi等[20]研究报道高迁移率族蛋白A2是癌基因，在子宫平滑肌肉瘤中是miR-Let-7的下游靶基因。Wang等[21]发现miR-Let-7a通过抑制信号传导及转录激活因子3影响肝癌的发生。总之，这些研究数据表明miR-Let-7家族在恶性肿瘤中扮演重要角色。因此，miR-Let-7b/i可能成为靶向治疗胶质瘤的新的靶点。

综上所述，敲低IKKε后可降低YAP1蛋白表达，但是不影响YAP1 mRNA的表达，增加miR-Let-7b/i的表达。然后，关于YAP1对miR-Let-7b/i的影响的研究显示，敲低YAP1后miR-Let-7b/i表达升高。因此，IKKε可通过IKKε-YAP1-miR-let-7b/i通路促进胶质母细胞瘤的发展，阻碍该通路可能是治疗胶质母细胞瘤的一种新的治疗策略。