采后伽师瓜和86-1甜瓜果实抗链格孢菌侵染研究

玛尔哈巴·帕尔哈提 白羽嘉,2 王 瑾 朱婉彤 阿迪莱·图尔荪 冯作山

(1. 新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2. 新疆农业大学作物学博士后流动站，新疆 乌鲁木齐 830000)

甜瓜(CucumismeloL.)是新疆重要的果品特产之一[1-2]。在整个生长时期，甜瓜均可能受到链格孢菌(Alternariaalternata)侵染而引发黑斑病。黑斑病发病初期呈浅黄褐色，后期病斑明显变黑，病、健组织之间分界明显，伴随表皮凹陷，果肉呈海绵状黑色团块[3-5]。伽师瓜和86-1甜瓜是新疆主要甜瓜品种，多产于新疆喀什地区，其中伽师县产量位居第一[6]。

当植物受到病原菌侵染时，往往分泌几丁质酶(CHT)与β-1,3-葡聚糖酶(GLU)等病程相关蛋白，来提高自身防御能力。目前果实采后病程相关蛋白的研究也主要集中在CHT[7-8]和GLU上[9-10]。也有研究[11-13]表明，抗坏血酸过氧化物酶(APX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)在植物抗病性方面起着重要作用。植物受病害侵染可诱导这些保护酶产生变化，增强抗病能力[14]。目前，有关甜瓜抗病菌侵染的研究[15-17]多见于其果肉组织上，本研究拟以伽师瓜和86-1甜瓜为试材，取其果肉及果皮组织为试验对象，比较二者抵抗病原菌侵染能力的差异，以期为选择培育优良甜瓜品种和甜瓜采后病害控制提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

伽师瓜、86-1甜瓜：采摘自新疆喀什地区伽师县三乡，选取无病虫害、无机械损伤果实，伽师瓜单果重(4.0±0.5) kg，全生育期110～120 d，中心可溶性固形物14.0%，边部可溶性固形物9.0%。86-1甜瓜单果重(3.5±0.5) kg，全生育期115 d左右，中心可溶性固形物14.0%，边部可溶性固形物9.8%；

链格孢：分离自伽师瓜自然发病的果实，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基于4 ℃保存；

冰醋酸、无水醋酸钠、聚乙二醇6000、聚乙烯吡咯烷酮(K30)、曲拉通、愈创木酚、30% H2O2溶液、邻苯二酚、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、丙酮、浓盐酸、盐酸、乙醇、五水合四硼酸钾、对二甲氨基苯甲醛、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、抗坏血酸：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二钠、L-蛋氨酸、氮蓝四唑、核黄素：分析纯，生工生物工程(上海)股份有限公司；

几丁质：分析纯，美国西格玛奥德里奇公司；

脱盐蜗牛酶、β-巯基乙醇：分析纯，上海索莱宝生物科技有限公司；

葡萄糖、琼脂：生物试剂，北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

电子天平：FA2104N型，上海民桥精密科学仪器有限公司；

pH计：FE20型，梅特勒-托利多仪器有限公司；

无菌操作台：NBCJ-B型，上海鸿都电子科技有限公司；

恒温霉菌培养箱：MHP-250型，上海鸿都电子科技有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：LDZX-50KBS型，上海申安医疗器械厂；

显微镜：XSP-2C型，上海蔡康光学仪器有限公司；

高速分散器：XHF-DY型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

高速冷冻离心机：TGL-16G型，上海安亭科学仪器厂；

紫外—可见分光光度计：TU-1810PC型，北京普析通用公司；

超声波清洗器：SK2200H型，上海科导超声仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：DZKW-S-4型，北京市永光明医疗仪器厂；

气体传输泵：2XZ-2型，临海市谭氏真空设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

(1) 马铃薯葡萄糖琼脂培养基的制备：将马铃薯去皮切块，称取200 g放入1 000 mL蒸馏水中煮沸至发软，用纱布过滤，补加蒸馏水至1 000 mL。加入20 g葡萄糖与15 g琼脂，搅拌溶解，分装至250 mL锥形瓶，121 ℃ 高压灭菌20 min，倒平板备用。

(2) 孢子悬浮液的制备：将保藏链格孢菌种的培养基在无菌操作台打开，用高温灭菌过的镊子取适量菌落，转移至马铃薯葡萄糖琼脂培养基，27 ℃黑暗培养7 d后用显微镜观察菌落特征，确认为所需菌种，收集孢子。用含有 0.01% Tween-80 的无菌水配制浓度为1×106个/mL 孢子悬浮液备用。

(3) 甜瓜预处理：用自来水冲洗，再用2%过氧化氢清洗并浸泡30 s消毒，最后用无菌水冲洗3遍，晾干备用，放入7 ℃ 冷库预冷。

(4) 接种与取样：在甜瓜果实赤道等距刺入3 个深度为5 mm的伤口(直径3.5 mm)，吸取20 μL上述孢子悬浮液接入，对照组接入等量无菌水，用塑料胶条封住，装箱，置于7 ℃、相对湿度85%～90%冷库贮藏。

(5) 取样：在0，3，6，9，12，15，18，21，24，27，30 d后观察，取伤口周围5 mm处果皮和果肉组织，液氮速冻，-80 ℃保存。每处理用果实10个。

1.2.2 病斑直径测量 将接种链格孢菌的甜瓜沿3个伤口处切开，每次取4个瓜，切开的两半瓜都测取，取平均值。

1.2.3 CHT和GLU活性测定 参照文献[18]。

1.2.4 保护酶活性测定

(1) APX活性测定：参照文献[19]。

(2) SOD活性测定：采用氮蓝四唑光化还原法[20]。

(3) POD活性测定：参照Zauberman等[21]方法并做修改。称取10 g冷冻果肉组织和5 g冷冻果皮组织，分别加入10，20 mL提取缓冲液(50 mmol/L pH 5.5 醋酸缓冲液，1 mmol/L 聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成匀浆后，于4 ℃、8 000×g离心30 min，上清液即为POD酶提取液。酶促反应体系：25 mmol/L 愈创木酚溶液3 mL，0.5 mL酶提取液， 0.5 mol/L H2O2溶液200 μL。以蒸馏水为空白，立即在波长470 nm处测定吸光度值，然后每隔1 min 测定1次，连续测定6 min。以每克鲜重样品每分钟吸光度值增加1时为1个POD活性单位(U)，结果以U/g表示。

(4) PPO活性测定：参照Zauberman等[21]的方法并做修改。称取10 g冷冻果肉组织和5 g冷冻果皮组织，分别加入10，20 mL提取缓冲液(100 mmol/L pH 5.5 醋酸缓冲液，1 mmol/L聚乙二醇6000，4 g/100 g聚乙烯吡咯烷酮K30，1 g/100 g 曲拉通)，充分研磨成匀浆后，于4 ℃、8 000×g离心30 min，上清液即为PPO酶提取液。酶促反应体系：50 mmol/L、pH 5.5醋酸缓冲液4 mL， 50 mmol/L邻苯二酚溶液1 mL，100 μL 酶提取液。以蒸馏水为参比空白，立即在波长420 nm 处测定吸光度值，然后每隔1 min 测定1次，连续测定6 min。以每克鲜重样品每分钟吸光度变化值增加1时为1个PPO活性单位(U)，结果以U/g表示。

1.3 数据处理

使用SPSS 20.0软件进行差异性显著分析，P<0.05 表示差异显著，利用Excel 2016进行数据处理及绘图，试验重复3次。结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 链格孢侵染甜瓜果实病斑直径的变化

病斑直径可直接反映果实的病情变化。由图1可知，第12天2种甜瓜均开始出现黑色病斑，由果皮向果肉发散扩大，与蒋黎艳等[22]对温州蜜柑的研究结果相一致。果皮和果肉的病斑直径随着贮藏天数的增加均逐渐扩大，果肉病斑直径始终大于果皮。但与86-1甜瓜相比，伽师瓜病斑直径扩展相对较慢。第30天，86-1甜瓜果皮和果肉病斑直径分别是伽师瓜果皮和果肉的1.14，1.06倍。从甜瓜组织分析，果皮较果肉可显著抑制甜瓜的链格孢病斑直径扩大(P<0.05)，病斑直径增长速度比果肉慢，与其它品种相比，伽师瓜比86-1甜瓜对抵御链格孢病菌侵染具有更强能力，且病斑直径增长速度低于86-1甜瓜。同时本试验还发现，伽师瓜和86-1甜瓜果皮和果肉在同一天开始出现病斑，与张培岭等[23]的研究结果一致。

图1 链格孢侵染对2种甜瓜病斑直径的影响Figure 1 Effects of Alternaria alternata infection on the lesions diameter of two melons

2.2 链格孢侵染对甜瓜果实病程相关蛋白活性的影响

2.2.1 CHT活性 病原菌引起植物抗病性机制不是单一的机制，存在着多种机制甚至是多种机制协同作用的结果[24]。大部分病原菌细胞壁的主要成分含有几丁质，而CHT可以有效地将其分解，从而破坏病原菌结构达到抑制病原菌的作用[25]。由图2可知，贮藏期间2种甜瓜果皮和果肉的CHT活性都呈先上升后下降的趋势。伽师瓜和86-1甜瓜接种果皮分别在18～30，15～21 d CHT活性保持较高水平，说明甜瓜自身的抗病系统在这段时间发挥显著作用，导致酶活性升高。9 d前各处理增长缓慢，在此之后迅速增长并相继出现高峰，高峰之后缓慢下降，且2种甜瓜接种果皮均高于对照。伽师瓜接种果皮在第21天出现明显高峰，是对照峰值的1.75倍。86-1甜瓜接种果皮CHT活性峰值提前3 d出现，是对照峰值的1.77倍，但仅为伽师瓜接种果皮峰值的50.74%。2种甜瓜接种果肉CHT活性变化较对照果肉更明显。伽师瓜接种果肉CHT活性变化在第9天后迅速增大，在第18～24天保持较高CHT活性。86-1甜瓜接种果肉从第3天后CHT活性明显增加，在第6～9天活性高于伽师瓜接种果肉，但差异不显著，第18天出现CHT活性峰值，是伽师瓜接种果肉峰值的79.17%。单春会[26]将青霉菌接种于伽师瓜发现果实中CHT在不同侵染阶段启动相应反应，这与本研究结果相似。

2.2.2 GLU活性 GLU存在于大部分高等植物中，与CHT协同作用下可明显抑制病原菌的生长[27]。由图3可知，整个贮藏期间2种甜瓜果皮和果肉GLU活性都呈先上升后下降的趋势，与果实CHT活性有着相似变化。对于果皮，伽师瓜接种果皮GLU活性持续上升，在第24天出现峰值，86-1甜瓜接种果皮GLU活性缓慢上升，提前3 d达到最大活性值。伽师瓜和86-1甜瓜接种果皮均高于对照(P<0.05)。果肉趋势与果皮相似，2种甜瓜果肉接种组均在第21天出现GLU活性峰值。伽师瓜接种果肉在第9天迅速升高随后出现明显峰值，是对照的2.42倍，这与CHT在伽师瓜接种果肉中活性变化表现相似，说明CHT可以和GLU协同，产生强烈抵抗作用，共同抵御链格孢菌侵染。86-1甜瓜接种果肉在贮藏前期GLU活性表现平缓，第21天达到GLU活性高峰后缓慢下降。柴喜荣等[28]发现黄瓜抵御疫病过程中，果实中GLU与CHT均显著增加，并与黄瓜品种抗病性呈正相关。这表明，当植物受到病原菌侵染时，往往分泌CHT与GLU等病程相关蛋白，来提高自身防御能力。

图2 链格孢侵染对2种甜瓜CHT活性的影响Figure 2 Effects of Alternaria alternata infection on CHT activity of two melons

图3 链格孢侵染对2种甜瓜GLU活性的影响Figure 3 Effects of Alternaria alternata infection on GLU activity of two melons

2.3 链格孢侵染对甜瓜果实保护酶活性的影响

2.3.1 APX活性 保护酶也与植物体抗病、抗病原菌入侵能力密切相关。APX可以有效清除细胞内多种胁迫环境下产生的过多活性氧，使果实体系处于相对平衡状态，对细胞产生保护作用[29]。由图4可知，随着贮藏天数的延长，2种甜瓜果皮和果肉的APX活性都不断上升，在第30天有最大活性值。对于果皮，伽师瓜接种果皮在第15天迅速升高，而86-1甜瓜接种果皮总体缓慢上升，在上升期间，前者约是后者的2倍。对于果肉，伽师瓜接种果肉APX活性在第9天明显升高，同时期86-1甜瓜接种果肉增长缓慢，说明APX在伽师瓜接种果肉贮藏前期就起到保护作用，一直维持到贮藏结束。有研究[30]表明，经吡唑并嘧啶衍生物诱导的黄瓜接种尖孢镰孢菌后，保护酶APX活性有所提高，且有APX基因表达。

2.3.2 SOD活性 由图5可知，贮藏期间2种甜瓜的果皮和果肉SOD活性都呈先上升后下降的趋势。对于果皮，伽师瓜接种果皮SOD活性涨幅趋势明显，其他处理SOD活性变化波动不大，可能是受链格孢菌侵染，伽师瓜接种果皮在这段时间内产生大量活性氧，诱导SOD活性提高，起到了防御氧自由基产生的第一道防线作用[31]。伽师瓜和86-1甜瓜接种果皮分别在第18天和第21天出现活性高峰，前者是后者的3.67倍。对于果肉，伽师瓜和86-1甜瓜接种果肉SOD活性变化相似，峰值均在贮藏第21天出现，伽师瓜接种果肉SOD活性整体显著高于86-1甜瓜的(P<0.05)。2种甜瓜果肉组SOD活性变化较果皮组平缓，可能是甜瓜受链格孢病菌侵染后，果皮比果肉发挥更积极的抵御作用。研究[32]发现，对不同感抗品种柑橘经毒素处理，抗性品种柑橘SOD活性分别在处理初期和末期出现2次活性最大值。

图4 链格孢侵染对2种甜瓜APX活性的影响Figure 4 Effects of Alternaria alternata infection on APX activity of two melons

图5 链格孢侵染对2种甜瓜SOD活性的影响Figure 5 Effects of Alternaria alternata infection on SOD activity of two melons

2.3.3 POD活性 POD一方面在清除、阻止活性氧形成起着重要作用，另一方面，它与一些抗性物质如总酚、黄酮、木质素等的合成有紧密联系[33-34]。由图6可知，贮藏期间伽师瓜和86-1 2种甜瓜的果皮和果肉POD活性都呈先上升后下降的趋势。对于果皮，伽师瓜接种果皮在第12～18天连续出现较高POD活性，并在第12天出现POD活性峰值，整个贮藏期间POD活性均高于对照(P<0.05)。86-1甜瓜接种果皮在第18天缓慢上升到高峰值后迅速下降，除第24天和第27天外，POD活性均高于对照(P<0.05)。对于果肉，伽师瓜接种果肉在贮藏前期POD活性直线上升，第12天出现POD活性峰值随后急剧下降。86-1甜瓜接种果肉在第6天迅速达到POD活性高峰后缓慢下降。同样的结果在香蕉果实中也有发现[35]。

2.3.4 PPO活性 PPO活性的增加是果实受病原菌侵染后发生的典型变化，PPO与POD两者协同可以为果实细胞提供防御，以减少病原菌造成的伤害，因此被认为是植物的保护酶之一[36]。由图7可知，贮藏期间2种甜瓜果皮和果肉的PPO活性都呈先上升后下降的趋势。对于果皮，伽师瓜果皮PPO活性峰值较86-1甜瓜晚12 d出现，除第12天外，伽师瓜接种果皮PPO活性均大于86-1甜瓜，说明PPO在贮藏后期对伽师瓜果皮抵御病原菌侵染起了主要作用，且抵抗作用

图6 链格孢侵染对2种甜瓜POD活性的影响Figure 6 Effects of Alternaria alternata infection on POD activity of two melons

图7 链格孢侵染对2种甜瓜PPO活性的影响Figure 7 Effects of Alternaria alternata infection on PPO activity of two melons

大于86-1甜瓜。对于果肉，伽师瓜接种果肉在第12天出现明显PPO活性峰值，是对照的1.26倍。86-1甜瓜接种果肉在第18天出现PPO活性峰值，是对照的1.06倍。第15天开始，86-1甜瓜接种和对照果肉均高于伽师瓜接种和对照果肉，这是因为伽师瓜在前期表现较强烈的抵御作用，随着时间的推移慢慢减少，导致PPO活性低于86-1甜瓜。同样在不同品种苹果果实对抗灰霉病时，PPO活性表现为高抗品种高于感病品种高于高感品种[37]。

3 结论

本研究结果表明，伽师瓜病斑直径小于86-1甜瓜，果皮病斑直径小于果肉，说明伽师瓜比86-1甜瓜能更好地抵御链格孢侵染，其果皮也比果肉能更好保护果实不受病原菌损害。整个贮藏期间，增强的CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性与甜瓜果实对链格孢侵染抗病性紧密相关。与86-1甜瓜相比，伽师瓜果实中CHT、GLU、APX、SOD、POD和PPO活性更高。说明伽师瓜比86-1甜瓜有更积极的防御链格孢侵染作用，尤其在贮藏中后期作用显著。今后的研究重点可以从同工酶电泳和分子水平等方向深入阐述甜瓜果实对链格孢侵染的抗病性机制，挖掘影响甜瓜抗病性的关键基因及代谢途径。