羊栖菜多糖分离工艺的研究

高坛玉，刘思渊，林国荣

（莆田学院环境与生物工程学院，福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建 莆田 351100）

羊栖菜又名海大麦、玉草等，是北太平洋西部特有的暖温带性海藻，广泛分布于我国辽宁、山东、福建、浙江省沿海，具有软坚散结，利水泄热等功效，且藻体肥厚多汁，富含多糖、膳食纤维、蛋白质、维生素和矿物质，以及人体所需的各种微量元素和八种必需氨基酸。它可作为工业用褐藻胶原料和药品，临床上多用于治疗甲状腺肿、淋巴浮肿病、脚气病等，具有很高的食用和药用价值。

羊 栖 菜 多 糖 （SargassumfusiformePolyccharides，SFPS）是指从羊栖菜中提取的水溶性多糖，主要由褐藻酸和褐藻糖胶组成。羊栖菜多糖具有增强机体免疫力、抑制肿瘤细胞、抗菌和抗病毒等生理活性。多糖是羊栖菜中的主要活性成分，研究发现多糖的生物学功能与其化学性质有关，只有分离出多糖的有效成分并明确其结构特征，才能进一步研究其药理活性。

以羊栖菜为原料，用热水浸提法提取羊栖菜多糖粗品，筛选出最优树脂对羊栖菜多糖进行分离纯化，确定最佳多糖提取和分离纯化参数，为羊栖菜多糖的开发与应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试供材料及处理

将羊栖菜粉碎烘干，在冰箱中保存待用。

1.2 主要化学试剂与仪器

主要试剂：无水乙醇（天津市鼎盛鑫化工有限公司），苯酚（天津市鼎盛鑫化工有限公司），浓硫酸（国药集团化学试剂有限公司），大孔树脂HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 （上海蓝季科技发展公司）。

主要仪器：SartoriusBS224S电子天平（Sartorius公司）、DK-S24型电热恒温水浴锅（上海精胜科学仪器有限公司）、YZ1515x衡流泵（保定兰格衡流泵有限公司）、722型可见光分光光度计（上海精密科学仪器公司）、pH计 （厦门精益兴业公司）、BS-100A收集器（苏州江东精密仪器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖标准曲线的制作

1）葡萄糖标准溶液配制 用分析天平精密称取干燥后的葡萄糖5.00mg，加适量水溶解并于50 mL容量瓶中定容，配置成0.1 mg／mL的葡萄糖标准溶液。

2）葡萄糖标准曲线制作 用移液管从上述配制的葡萄糖标准溶液中分别吸取 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1 mL，转入干净试管中，补加去离子水至1 mL。然后，运用硫酸-苯酚法依次加入2.5mL浓硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，摇匀并冷却到室温后静置20 min。以第一管为空白，在490 nm处测定吸光度A，再以吸光度A为纵坐标、糖浓度C为横坐标，得到回归方程。

1.3.2 提取工艺的确定取羊栖菜粉末 5.0 g，分别加入75 mL的去离子水和75 mL的乙醇，在60℃的水浴锅中提取2 h，再取5.0 g羊栖菜粉末加入75 mL去离子水在60℃超声波环境下提取0.5 h，通过测其吸光度选出最佳提取工艺。其次，取羊栖菜粉末5.0 g，运用最好的提取方法分别在45℃、60℃、75℃、90℃下加热2 h，得到不同温度下的羊栖菜多糖提取液，确定最优提取温度。再次，按照 1∶10，1∶12.5，1∶15，1∶20固液比，在上述试验后的最优温度下水浴加热2 h，确定最优提取固液比。最后，在水浴加热时间为1.5 h，2 h，2.5 h，3 h 的条件下，按照上述试验所得的最适温度和最适提取固液比进行试验，确定最适提取时间，即可确定羊栖菜多糖适宜提取工艺。

将上述不同条件下所得的提取液取1 mL于干燥洁净的试管中，依次加入2.5 mL浓硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，边滴加边震荡，冷却至室温后静置20 min，在490 nm处测其吸光度。

1.3.3 树脂的筛选

1）树脂预处理 树脂经预处理并用水冲洗，直到无色无味。

2）静态吸附 选用大孔树脂 HPD-100、HPD-400、HZ-801、HZ-818、NKA-9、LSA-5 各 5 mL， 分别加入羊栖菜多糖提取液80 mL，在100 r／min摇床上5次吸附。第一次为吸附2 h测一次吸光度，此后每隔1 h测一次吸光度，共吸附6 h。然后，将所得吸附液取1 mL于干燥洁净的试管中，依次加入2.5 mL浓硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，边滴加边震荡，冷却至室温后静置20 min，在490 nm处测其吸光度。

3）静态洗脱 在吸附后的树脂中加入60 mL 50%的乙醇，洗脱3h后将所得洗脱液取1 mL于干燥洁净的试管中，依次加入2.5 mL浓硫酸和0.5m L6%苯酚溶液，边滴加边震荡，冷却至室温后静置20 min，在490 nm处测其吸光度。

1.3.4 动态吸附

1）饱和吸附。NKA-9树脂在无水乙醇中浸泡24 h，用去离子水洗至中性。在层析柱中加入15 mL湿树脂，以2 BV的流速吸附羊栖菜多糖的提取液。经分部收集器收集得到漏出液，并在490 nm处测定吸光度。

2）动态吸附。采用水提取方式，1∶15固液比，在90℃条件下提取3 h得到提取液。经无水乙醇浸泡NKA-9树脂24 h后，用去离子水洗至中性，在玻璃层析柱中装填15 mL湿树脂，加入100 mL羊栖菜多糖提取液，在1 BV、2 BV、3 BV三种不同流速下进行动态吸附，以筛选出最优提取效果下的流速，再进行不同上样浓度的吸附。 按照 1∶10，1∶15，1∶20 不同固液比，在90℃下取提取液100 mL，在玻璃层析装填15 mL湿树脂，在最适流速下进行吸附处理。

取上述不同条件下的吸附液1 mL于干燥洁净的试管中，依次加入2.5 mL浓硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，边滴加边震荡，冷却至室温后静置20 min，在490 nm处测其吸光度。

1.3.5 动态洗脱对上述完成动态吸附的树脂柱用去离子水淋洗，然后低温保存处理。

取动态吸附后的树脂15 mL填装于玻璃层析柱中，然后用50%、60%和70%乙醇溶液120 ml进行洗脱处理，流速为2BV。 然后，以120 ml最佳乙醇浓度进行洗脱处理，流速为1BV、2BV和3 BV。取上述不同条件下的吸附液1 mL于干燥洁净的试管中，依次加入2.5 mL浓硫酸和0.5 mL 6%苯酚溶液，边滴加边震荡，冷却至室温后静置20 min，在490 nm处测其吸光度。

1.3.6 纯度测定

精准称取制备好的的样品，用甲醇作为溶剂，将样品溶解并定容至10 mL，同上法测定溶液吸光度，通过标准曲线计算出纯化后的多糖浓度，按照下式计算纯度：

式中，C为通过标准曲线计算出的纯化后果皮花青素的浓度，mg／mL， V 为定容体积，10 mL，m 为精准称取的样品质量，mg

2 结果与分析

2.1 多糖标准曲线的制作

羊栖菜多糖标准曲线见图1。

图1 多糖标准曲线Figure 1 Standard curve of polysaccharide

样液吸光度为A490 nm＝7.430，代入图1标准曲线方程，得出样液羊栖菜多糖质量浓度为1.046 mg／mL。

表1 不同提取方式对羊栖菜多糖提取的影响Table 1 Effect of different extraction mode on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

2.2 提取工艺的确定 不同提取方式对羊栖菜多糖提取的影响见表1。

2.2.1 提取方式的确定由表1可以看出，水提取法效果最好，乙醇提取法次之，超声波提取效果最差，故本试验选用水提取方式提取羊栖菜中的多糖。

2.2.2 提取温度的确定不同温度对羊栖菜多糖提取的影响见图2。

由图2可以看出，水提取法中羊栖菜多糖的提取效果随着温度的增加而增大，且增加幅度随温度升高而呈递增趋势。60℃之前，多糖提取量随温度升高而增加的速度较缓慢，在温度达到60℃以后，随着水浴温度的提高，多糖分子热运动随之加快，多糖提取量亦随之增加，60～75℃之间增速较快，75～90℃之间达到最快增速，温度达到90℃时为最佳提取效果。

图2 不同温度对羊栖菜多糖提取的影响Figure 2 Effect of different temperature on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

2.2.3 最适提取固液比的确定不同固液比对羊栖菜多糖提取的影响见图3。

图3 不同固液比对羊栖菜多糖提取的影响Figure 3 Effect of different solid-to-liquid ratio on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

由图3可以看出，多糖提取效果随固液比的变化而变化。当固液比小于1：15时，多糖提取效果逐渐递增；当固液比为1∶15时，羊栖菜多糖提取效果最好；随着固液比增大，其提取效果逐渐降低。造成此现象的原因是：当固液比小于1∶15时，其羊栖菜多糖没有完全溶解于水中，故提取效果较差；当固液比大于1∶15时，其溶液中水较多，对羊栖菜多糖起到稀释作用，且固液比越大，其溶液中多糖浓度就越小，继而提取效果随之下降。

2.2.4 不同时间条件下提取效果不同时间对羊栖菜多糖提取的影响见图4。

图4 不同时间对羊栖菜多糖提取的影响Figure 4 Different time on extraction of Sargassum fusiforme polysaccharides

由图4可以看出，羊栖菜多糖提取量随提取时间的增加而呈递增趋势，且随着时间的增加，多糖提取量的增大趋势逐渐减缓。当提取时间达到3 h时，多糖提取效果最好。

2.3 大孔树脂分离工艺的确定

2.3.1 大孔树脂筛选 大孔树脂静态吸附与解吸结果见表2。

表2 大孔树脂静态吸附与解吸结果Table 2 Static adsorption and desorption results of macroporous resin

从表2可知，随着时间的增加各个大孔树脂的吸附量逐渐增大，对羊栖菜多糖提取而言，吸附量最佳的是NKA-9，HZ-818次之，HPD-400最差；洗脱效果最好的是NKA-9，HZ-818次之，其中HB-801最差。由于NKA-9吸附能力最佳，洗脱效果最好且解吸率最高，故后续试验采用NKA-9型大孔树脂。

2.3.2 NKA-9大孔树脂对多糖饱和吸附量确定NKA-9大孔树脂饱和吸附曲线见图5。

由图5可以看出，以2BV的速度进行吸附，当上样量达到85 mL时，其吸附液吸光度变化很小，趋近于原液的40.71，但仍呈上升趋势。其最大吸附量为106.95 mg／mL，故决定动态吸附时的上样量为100 mL。

图5 NKA-9大孔树脂饱和吸附曲线Figure 5 Saturation adsorption curve of NKA-9 macroporous resin

2.4 动态吸附

2.4.1 NKA-9大孔树脂在不同流速下吸附效果不同流速下NKA-9大孔树脂的吸附曲线见图6。

图6 不同流速下NKA-9大孔树脂的吸附曲线Figure 6 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

从图6中可以看出，当流速为2 BV时，NKA-9对多糖的吸附效果明显优于1 BV和3 BV。吸附流速不同时会影响多糖在树脂中的扩散速度，吸附效果受溶质在树脂表面扩散速度的的影响。当流速为3 BV时，流速过大会导致树脂吸附量降低。当流速为1 BV时，吸附流速过小会导致吸附时间增加。当流速为2 BV时，其吸附效果最好，达到饱和时的上样体积为100 mL。

2.4.2 NKA-9大孔树脂在不同浓度下吸附效果不同浓度下NKA-9大孔树脂的吸附曲线见图7。

图7 不同浓度下NKA-9大孔树脂的吸附曲线Figure 7 Adsorption curve of NKA-9 macroporous resin with different concentration

从图7可以看出，不同浓度的提取液其吸附效果具有较为明显的差异。浓度越大时，提取液中的溶质极易造成大孔树脂堵塞，导致吸附效果上升缓慢；提取液浓度越小，其吸附时达到饱和所需要的提取液就越多。因此，羊栖菜多糖吸附的最适浓度为1.671 mg／mL。

2.5 动态洗脱

2.5.1 不同乙醇浓度下洗脱效果不同浓度下NKA-9大孔树脂的洗脱曲线见图8。

从表8可以看出，乙醇浓度越大其洗脱效果越好，当乙醇浓度达到70%时洗脱率最高，但到洗脱后期出现较明显的尾部。当乙醇浓度达到50%时，其洗脱效果远不及60%和70%乙醇的洗脱效果，故以60%乙醇为最佳洗脱浓度。

2.5.2 不同流速下洗脱效果不同流速下 NKA-9大孔树脂的洗脱曲线见图9。

图9 不同流速下NKA-9大孔树脂的洗脱曲线Figure 9 Elution curve of NKA-9 macroporous resin with different flow rate

从图9可以看出，NKA-9大孔树脂的洗脱效果与流速呈正相关。当流速达到3 BV时，洗脱出现高点，但在2 BV时其洗脱曲线呈现出更好的对称性，据此确定出2 BV的乙醇为最佳洗脱时的流速。

2.5.3 纯度测定精密称取冷冻干燥后的样品 0.0056 g，测定溶液吸光度，计算得到分离后的果皮多糖浓度为 0.353 mg／mL，纯度达到了 63.1%。

3 结论

羊栖菜多糖是从全藻中提取的一种水溶性多糖，包括褐藻酸、褐藻多糖硫酸酯及褐藻淀粉，具有抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖和促进机体生长发育等多种药理活性。试验表明：羊栖菜在1∶15的固液比，90℃温度加热3 h后，其提取效果最好。选用NKA-9大孔树脂进行吸附时，最适上样浓度为1.671 mg／mL，最适流速为2 BV；洗脱时流速为2 BV，乙醇浓度为60%，获得羊栖菜多糖的纯度达到63.1%。