羊附红细胞体解离方法的比较研究

唐 成

（四川省遂宁市船山区畜牧食品局，四川 遂宁 629000）

动物附红细胞体病是猪、牛、羊等多种动物包括人都能感染的人畜共患传染病。羊附红细胞体病的临床特征为贫血、体质虚弱。该病主要多发于绵羊养殖和生产比较多的国家，但其发病率不高，多呈潜伏感染，所以诊断有一定的难度。对羔羊的影响是发育不良，死亡率较低。目前该病的诊断多通过镜检，但准确性较差，已得到了业界的关注和研究。建立血清学诊断以及分子生物学诊断的前提条件是抗原纯化。而当前对该病的血清学诊断主要是利用粗制附红细胞体抗原，在抗原制备过程中，对溶液进行振荡和水溶操作易造成溶血现象，导致检测结果不准确。因此，研究出了一种羊附红细胞体高纯度抗原的有效制备方式——体外驱虫法。这一方法对羊附红细胞体病的诊断提供了先进的技术基础。

1 试验材料

主要是采集本地区羊养殖场的羊血，数量要大于800mL。在实验中主要使用的制剂是双向红莲灭，规格是每支10mL，由江西某动物药生产。

2 试验方法

2.1 血样采集

无菌采集羊血并加入柠檬酸钠抗凝剂。涂片镜检，红细胞感染率为10%左右，符合本次实验要求。

2.2 羊附红细胞体解离

将800mL的羊血平均分成4份，每份200mL。并分别标号为A、B、C、D。每份具体使用的解离方法如表1所示。

表1 羊附红细胞体解离方法

A组使用的是水溶法。具体的实验方法是将血液样本经过2000r/min的速度进行离心，10min以后去除了样本当中的血浆和白细胞等其他干扰物质。然后将剩余的红细胞用生理盐水洗3次。加入pH 2 PBS后上摇床振摇1h。而后立即用大约56℃的水对处理后的样本进行水浴2min。再离心10min后取上清液。

B、C、D组用的都是药物体外驱虫法。离心、生理盐水洗涤步骤同上。然后将处理后的样本加入足量的生理盐水至200mL，再加入准备好的双向红莲灭0.5mL，置4℃放置36h。这三组的步骤基本一致，差别在于双向红莲灭的剂量，C组使用的是1mL，D组使用的是2mL。

2.3 指标观察

主要是观察分离前后附红细胞体感染率（%）、红细胞感染强度（个）、附红细胞体数（1×104／mm3）、杂质含量和附红细胞体的运动性，一共是5项指标。

2.4 提取附红细胞体抗原

将药物体外驱虫法解离后的血液进行离心10min后取上清液。将水浴法和药物体外驱虫法所得的上清液离心40min，沉淀物就是附红细胞体抗原，加入生理盐水2mL。

2.5 制备羊附红细胞体抗原全蛋白悬液

将取得的羊附红细胞体抗原用超声波裂解约10min，即得到羊附红细胞体抗原全蛋白悬液。

2.6 羊附红细胞体全蛋白的SDS-PAGE

将这两中解离方法制备的全蛋白裂解液，按照SDS-PAGE的方式进行相关的处理，比较两者的区别。（见图1）

3 结果与分析

从表2可知，实验结果显示，使用体外驱虫法的三组其解离效果要好过水溶法。使用体外驱虫法的样本其红细胞的感染率和感染的强度都会降低，但是附红细胞体的活性受到一定的影响。而且根据实验3组的分析来看，双向红莲灭的浓度越高其解离效果越好。

从表3结果可以解离液裂解后测定的抗原蛋白浓度与使用体外驱虫法双向红莲灭的剂量成正相关。

用SDS－PAGE试验对利用水浴法与体外驱虫法制备的全蛋白测定得知，两者成分相同，都由4条带组成。

表2 不同方法附红细胞的解离效果

表3 抗原蛋白质浓度测定结果

4 讨论与分析

针对羊附红细胞体的解离方法，国内外动物学家都进行了一定的研究。水溶法是一种比较常用的方式，但有一定的缺陷，会影响到结果的准确。本文采用体外驱虫法对羊附红细胞体解离的效果好于水溶法。所以笔者认为，可以使用这种方法制备羊附红细胞体的抗原。但在实验的过程当中，我们也发现了该法的缺陷，有少量的溶血现象出现，所以该法还有一定的改进空间。

图1 羊附红细胞体抗原蛋白的SDS-PAGE电泳

[1]杨峰.农区散养户羊布病免疫技术要点及注意事项[J].甘肃畜牧兽医.2017(10).

[2]彭海生,等.畜禽附红细胞体生物学特性试验研究[J].畜牧与兽医.2015(01).