一例产气荚膜梭菌的实验室诊断报告

牛天明，王永强，李天旭，白皓承，刘 锴★.2

（1.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古 通辽 082000；2.内蒙古自治区肉牛疾病预防控制中心，内蒙古 通辽 028000）

内蒙古通辽市某肉羊牧场饲养的肉羊突然快速死亡，于是养殖户将死羊带到我校兽医实验室，进行化验，经流行病学调查、动物剖检、实验室诊断等方法，确定致病菌为产气荚膜梭菌，现将诊断过程如下：

1 发病情况

该牧场一共饲养360只肉羊，其中大羊285只，小羊75只，在一周前，突然有几只大羊发蔫、进食困难、精神萎靡、几小时后，倒地死亡，死后腹部有所膨大，口鼻有泡沫状液体流出，眼结膜潮红，肛门外凸，唇部有少量的水泡溃疡。

对羊进行病理解剖检查，发现瘤胃及肠道充气，打开瘤胃，可见很多未消化的饲料，剪开十二指肠，肠粘膜有丝状出血并且粘膜脱落，肠系膜淋巴结肿大，脾脏表面有暗红色出血点，腹腔积液。打开胸腔后，可见肝的颜色发白，胆囊充盈，心包积液，心衰，质感柔软，心耳呈紫黑色，肺部有少量的炎性坏死灶，肾脏表面淤血。

2 实验室诊断

2.1 病料染色镜检

无菌操作取出死羊的心、肝、脾、肺、肾、十二指肠，分别触片，革兰氏染色，镜检，可观察到两端钝圆着色，有荚膜，革兰氏阳性短杆菌，部分杆菌有芽孢。（见图1）

图1 革兰氏染色

2.2 细菌的分离培养

将上步取出的脏器分别接种到鲜血琼脂培养基内，37℃，厌氧培养12h，挑取长出的菌落在鲜血琼脂平板上画线接种培养，可见圆形、边缘整齐、灰白色、表面粗糙溶血菌落，溶血直径在10～15mm，经革兰氏染色，镜检为阳性芽孢杆菌，再将单菌落接种普通液体LB内，37℃，纯培养12h。

2.3 致病性实验

将纯培养液，12000r/min离心5min，吸取上清液0.5mL/只，腹腔注射，注射5只小鼠，另外注射5只小鼠0.5mL的生理盐水作为对照组，结果4h左右，注射纯培养液的小鼠，开始出现精神萎靡、躁动不安、闭眼发蔫等症状。8h左右，开始出现死亡，而注射生理盐水的小鼠未出现任何症状。对死亡小鼠进行剖检，可见小鼠脾脏有出血点，肾脏淤血，将其触片染色镜检，可见阳性芽孢杆菌。确定该菌为致病菌。

2.4 药物敏感试验

将该菌进行药物敏感实验，可知该菌对强力霉素、氯霉素、四环素、阿米卡星等药物敏感，而对氨苄西林、头孢噻肟等药物不敏感，最终可用强力霉素、四环素等抗生素对发病肉羊进行治疗。

3 分子生物学诊断

3.1 16s DNA的鉴定

首先对细菌进行DNA的提取，设计16s DNA通用引物，对其DNA进行PCR鉴定，16s DNA引物序列上游引物27F序列为AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物1429R序列为GGTTACCTTGTTACGACTT。

PCR反应体系，采用25μL反应体系，2μL PCR buffer（mg2+），1μL dNTP、上下游引物各 1μL、DNA 模板 2μL、Taq酶0.5μL、用水补齐至25μL。反应条件为94℃预变性3min、94℃变性 30s、56℃退火 30s、72℃延伸 1 min、共 30 个循环、72℃延伸7min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶中电泳，染色观察（如图2），并将PCR产物送到上海某公司测序

图2PCR电泳图

3.2 同源性比对

将测序结果在NCBI Blast上比对，比对结果显示，与产气荚膜梭菌同源性最高，相似率99%以上。由此可知，这例引起羊快速死亡的致病菌为产气荚膜梭菌。

4 预防与治疗

内蒙古地区产气荚膜梭菌每年在3～5月、10～12月高发，主要原因受本地的环境温度变化导致的，春季气温回升，但不稳定。冬季温度下降快，昼夜温差大等原因，都是产气荚膜梭菌发生的诱因。所以在高发时间，做好疫苗的免疫，目前，三联四防苗可有效的预防和控制产气荚膜梭菌的发生。饲养管理差也可能是导致产气荚膜梭菌发病的另一诱因，饲料的突变，突然的应激，畜舍的环境都可能产生产气荚膜梭菌发病。另外，产气荚膜梭菌发病不是单一种致病菌，常继发其他类疾病，所以在使用抗生素治疗时，切勿使用磺胺类药物和多粘菌素类药物，有可能加重发病动物的病情。