两种试验方法对一种阳性溶血材料的溶血性能的研究

赵增琳 屈秋锦 侯丽 刘香东 董秀丽 山东省医疗器械产品质量检验中心；山东省医疗器械生物学评价重点实验室 （山东 济南 250101）

医疗器械/材料的溶血作用是指医疗器械/材料表面或其可溶出物可导致红细胞膜破坏，血浆中游离血红蛋白增加，从而产生的毒性生物学作用。故医疗器械或材料介导的溶血试验可分为直接接触法和间接接触法。

目前，国际上公认的材料引起的溶血试验方法包括：美国国立卫生院（NIH）吸光度测定法（直接接触法）、美国材料试验协会（ASTM）血红蛋白浓度测定法（直接接触法和间接接触法）[6]。GB/T 16886.4中给出了医疗器械/材料血液相容性的试验方法以及试验的选择策略，但并未给出具体的试验操作方法。国家标准GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法》给出了针对注射器具的溶血检查法试验。NIH方法和GB/T 14233.2-2005方法原理相同，均仅包含直接接触法，不能涵盖间接接触法所导致的溶血情况。本文选取可引起一定溶血程度的丁腈手套为试验材料，通过吸光度测定和血红蛋白浓度测定两种方法，同时，每种方法均采用直接接触和间接接触两种方式评价医疗器械材料介导的溶血性能，对两种溶血检查方法进行比较。

1.资料与方法

1.1 临床资料

试验材料：丁腈手套（麦迪康），取手掌部位，裁剪成1cm×3cm大小的条状；阴性材料：聚乙烯材料（市售）；阳性对照：蒸馏水。

仪器设备：紫外可见分光光度计（U-3900H）。

1.2 方法

1.2.1 血液制备

血液制备采用吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法。①吸光度测定法：分别从3只健康家兔采集血液，收集在抗凝管中并混合在一起。取8mL混合血液，加入到含10mL生理盐水中，轻轻混匀制备稀释血液。②血红蛋白浓度测定法：分别从3只健康家兔心脏各抽取约5mL血液，收集在抗凝管中并混合在一起。

1.2.1 吸光度测定溶血法

直接接触法：按照6cm2:1mL的比例，取60cm2丁腈材料，加10mL 0.9%氯化钠注射液；阴性对照组每管加入10mL 0.9%氯化钠注射液；阳性对照组每管加入10mL蒸馏水。各组平行操作3管。同时制备1管空白管，加入10mL 0.9%氯化钠注射液。

间接接触法：参照GB/T16886.12-2005[3]中浸提液制备方法，按照6cm2:1mL的比例，取120cm2丁腈手套加20mL 0.9%氯化钠注射液；阴性对照组每管加入10mL 0.9%氯化钠注射液；阳性对照组每管加入10mL蒸馏水。各组平行操作3管。同时制备1管空白管，加入10mL 0.9%氯化钠注射液。全部试管于（37±1）˚C，60r/min振荡（72±2）h制备浸提液。浸提后混匀并转移10mL浸提液至对应新的玻璃试管中作为100%浓度浸提液。另取浸提液稀释至60%浓度稀释液。

孵育及检测[2]：将全部试管放入恒温水浴中（37±1）˚C孵育30min后，按0.2mL稀释血液/10mL生理盐水的比例，在每个试管中（除空白管外）加入稀释血液继续孵育（60±5）min。经800g离心5min，吸取上清液在分光光度计545nm波长处测定吸光度。试验组和对照组均取3支试管的吸光度平均值。

评判标准：阴性对照组的吸光度应不大于0.03，阳性对照组的吸光度应为0.9±0.2。否则应重新试验。溶血率的测定结果大于5%表明试验样品具有明显的溶血作用。

1.2.2 血红蛋白浓度测定溶血法[1]

直接接触法：按照6cm2:1mL的比例，取42cm2丁腈材料，加入7mL CMF-PBS；同法制备阴性对照组（42cm2聚乙烯材料加入7mL CMF-PBS），空白对照组加入7mL CMFPBS；每组平行操作3管。

间接接触法：参照GB/T16886.12-2005[3]中浸提液制备方法，按照6cm2:1mL的比例，取120cm2丁腈手套加入20mL CMF-PBS；同时制备阴性对照组（120cm2聚乙烯材料加入20mL CMF-PBS）和空白对照组，每组平行操作3管。全部试管于（37±1）˚C，60r/min振荡（72±2）h制备浸提液。

浸提后混匀分别转移7mL浸提液至各玻璃试管中作为100%的浸提液，另取浸提液配制60%浓度稀释液。

血红蛋白标准曲线的制备：试验前新鲜配制标准品稀释液（用棕色瓶），将标准品贮存液按下表用都氏试剂进行系列稀释（平行3管）。见表1。

表1. 血红蛋白标准曲线配制表

与血液相互作用：按照1mL血/7mL试验液的比例，将每支试管加入血红蛋白浓度为（10±1）mg/mL的稀释兔血，于恒温水浴中（37±1）˚C放置3h，每隔30min颠倒混匀两次以确保血液与试验样品充分接触。倒出管内液体，以750g离心15min。记录上清液颜色并取1mL上清液加至1mL都氏试剂中，混匀，室温避光放置15min。用都氏试剂调零，分光光度计在540nm波长处测定吸光度。

结果计算及判定：

校准溶血率（HR）测定：

式中：

HR：与空白对照相比的校准溶血率，%

AB：空白对照吸光度

注：所用AT和AB为平均值，分别计算每管的溶血率。

将此校准溶血率（HR）减去阴性对照组的校准溶血率即为与阴性对照相比的校准溶血率（HRʹ）。阴性对照材料的HR应小于2%，阳性对照材料的HR应大于5%，否则应重新进行试验。按如下分级判定试验结果：①试验样品的HR′在0～2%，视为非溶血；②试验样品的HRʹ在2%～5%，视为轻度溶血；③试验样品的HRʹ大于5%，视为溶血。

2.结果

2.1 吸光度测定法

直接接触血液时，吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法结果没有差异（P＞0.05）。60%浓度稀释液时，虽然所有结果都在同一判定标准中（都为溶血性），但吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法结果有显著性差异（P＜0.01）。100%浓度浸提液时，吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法结果没有差异（P＞0.05），均为全部溶血。吸光度测定溶血法直接接触法和间接接触法之间比较有差异，但是都为同一溶血性判定标准。见表2、表3。

表2. 吸光度测定法-直接接触法结果

表3. 吸光度测定溶血法间接接触法结果

2.2 血红蛋白浓度测定溶血法

直接法之间没有差异，结果为溶血性结果（溶血率＞5%）；间接法中60%浓度稀释液结果之间均无差异，且都为溶血性结果（溶血率＞5%），100%浓度浸提液结果之间没有差异，且都为溶血性结果（溶血率＞5%），60%浓度稀释液和100%浓度浸提液之间结果无差异（溶血率＞5%）。

直接接触法测定结果见表4。

表4. 血红蛋白浓度测定溶血法直接接触法结果

间接接触法测定结果见表5。

表5. 血红蛋白浓度测定溶血法间接接触法结果

3.讨论

3.1 试验对象的选择

通过本实验室对多种材料溶血性能的比较发现，丁腈材料具有一定程度的溶血作用，故本次研究中选取丁腈手套做试验材料，以便更好地评价不同试验方法产生的溶血率。为保证试验材料的平行性，选取厚度均一、面积易测量的手掌部位并剪成大小一致的条状。由于丁腈材料的溶血率较大，为了进一步比较不同方法间间接接触法溶血率的大小，用了100%浸提液外，还将浸提液进一步稀释，即选择60%浓度稀释液进行了试验。

3.2 直接接触法

本研究结果表明吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法的直接接触法之间均没有明显差异，说明考察试验材料表面接触血液对红细胞的影响时，两种方法中对溶血性能的评价是稳定且一致的。但应注意的是，直接接触法时平行管之间的结果会存在轻微差异，分析这种差异产生的原因，可能是丁腈手套本身为薄片，在试管中贴敷过紧，易产生重叠或贴壁，致使材料与血液接触面积不充分，建议在样品制备中尽量将测试材料充分展开，与红细胞充分接触，以便消除试验误差[5]。

3.3 间接接触法

间接接触法是指医疗器械/材料中可溶出物与红细胞接触导致的溶血作用，避免了因材料的物理形状或性状直接引起的溶血[4]，较少出现直接接触法材料与血细胞接触不均一带来的结果误差。不论吸光度测定法还是血红蛋白浓度测定法都是三只兔血混合，消除了个体差异，而且血红蛋白浓度测定溶血法采用同种阴性材料，符合GB/T16886.12的要求。100%浓度浸提液时，两种测定方法结果之间没有差异，均为全部溶血。60%浓度稀释液时，吸光度法溶血率值明显低于血红蛋白浓度测定法，有显著差异。血红蛋白浓度测定法60%浓度稀释液和100%浓度浸提液均使测试材料产生100%溶血，这是因为血红蛋白浓度测定法规定与材料接触之前，测定稀释血红蛋白浓度并将其调整到一定的浓度，除筛除自身溶血情况外，氰化血红蛋白的稳定性也使试验结果具有较强的稳定性。在吸光度法中，血液稀释虽然有一定的要求，但没有对其稀释浓度进一步规定，不同试验结果间可能会存在一定的偏差。

本次比较中，直接接触法和间接接触法两种不同接触方式下溶血率的结果不同，直接接触法溶血率结果相对小一些，这说明丁腈材料的可溶出物比材料表面物理和化学因素接触血液对红细胞带来的影响大。GB/T16886.4中对特定医疗器械直接接触法和间接接触法如何选择并没有明确规定。为了获得较为全面的数据信息，当医疗器械/材料是直接与血液接触的情况下，推荐选择直接接触法和间接接触法进行试验；当医疗器械/材料间接接触血液接触血液情况下，推荐选择间接接触法进行试验。建议根据医疗器械/材料的临床使用特性选择相应的试验方法全面评估溶血潜能。

吸光度测定法和血红蛋白浓度测定法的敏感度不同。血红蛋白测定法结果相对稳定，但试验过程需要使用氰化剂，有潜在毒性和环境危害性。吸光度测定法步骤较简洁快速，操作性强。在实际检测中，鉴于溶血试验的评价方法简繁各异、形式多样，在评估医疗器械或材料的溶血潜能时，特别是溶血率在临界水平时，应进一步考虑样品制备和试验方法的合理性，更有意义的是在某一特定实验室中用同种方法对材料或器械的比较研究，而不是不同数据间的绝对比较。

[1]ASTM F 756-08(2008).Standard Practice for Assessment of Hemolytic Properties of Materials[S].ASTM International,West Conshohocken,PA.2008.

[2]GB/T 14233.2-2005,Test methods for infusion,transfusion,injection equipment for medical use -Part2:Biological test methods[S].2005.

[3]BS Institution.ISO 10993-12:2007,Biological evaluation of medical devices -Part 12:Sample preparation and reference materials[S].2007.

[4]孙皎,刘义荣,钱云芳.生物材料试样形状对溶血率的影响[J].口腔材料器械杂志,1993,2(2):17.

[5]乔春霞,侯丽,赵增琳.医疗器械溶血性能评价方法-ASTM直接接触法和间接接触法比较[J].生物医学工程研究,2014,33(4):264-267.

[6]乔春霞,侯丽,赵增琳.医疗器械溶血性能三种评价方法的比较[J].中国医疗器械信息,2013,19(3):61-65.