干细胞来源外泌体在心肌梗死后心脏修复的研究进展

赵永超，石蓓

(遵义医学院附属医院，贵州遵义563000)

我国步入老年化社会，缺血性心肌病发病率及病死率居高不下，目前临床上治疗手段主要有药物治疗、支架置入术、冠脉搭桥等，然而这些传统技术仅能挽救濒危的心肌细胞，并不能使梗死的心肌细胞再生。胚胎干细胞、成体干细胞以及骨髓源性干细胞在临床上的应用为缺血性心肌病患者带来曙光。干细胞具有多向分化特性，可通过分化为特定细胞谱系的特异组织发挥生物学效应。目前研究较多的干细胞可分为胚胎干细胞[1]、多能干细胞[2]、成体干细胞[1,3]三大类，而成体干细胞根据组织来源又可细分为间充质干细胞(MSCs)、内皮祖细胞(EPCs)、心脏祖/干细胞(CPCs/CSCs)。迄今为止，因为成体干细胞提取自自体组织，所以具有伦理压力及免疫排斥较小、易于分离提取等优势，使得成体干细胞广泛应用于心肌梗死后心脏再生治疗。干细胞治疗虽然能明显改善心肌梗死后心脏功能，但是其具有致畸作用、排斥反应等危险，并且干细胞获取困难、移植细胞定植率低、难以增殖分化等困难，使得干细胞临床应用受限。至今，越来越多的实验及临床研究提示[2, 4]，干细胞移植后主要通过旁分泌途径分泌外泌体作用于受损区域的内源性成体CSCs/心肌细胞，发挥抗细胞凋亡、抗纤维化形成、促进血管新生、促进心肌细胞分化进而改善心功能。

1 外泌体的生物学特征

既往人们认为外泌体是细胞排泄废物的重要机制之一，然而近年研究表明，外泌体是细胞与细胞之间进行信息交流的重要媒介物质。外泌体[5]是一类由哺乳动物细胞通过旁分泌方式分泌的天然的内源性纳米级囊泡(直径30～100 nm)，可通过超速离心法或试剂盒法等多种方法从细胞条件培养基及多种体液(如血液、唾液、汗液、泪液、精液、尿液等)中分离提取。外泌体由细胞芽生而成，其质膜上会表达一些保守蛋白，如跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)，此外根据细胞的不同来源外泌体膜上还可能携带某些细胞特异性膜蛋白，如MSCs来源的外泌体可能携带CD29分子。外泌体可携带多种信息成分，包括蛋白质因子、脂质体、基因片段、非编码RNA等，需要特别提出的是，其分子成分与水平变化随来源细胞类型、大小、分化阶段及其所处微环境的不同而存在差异。外泌体通过抗体配体配对机制被靶细胞识别、内化或以质膜融合方式，将其携带的遗传信息分子传递给靶细胞，影响其生物学进程。

2 干细胞非细胞治疗

干细胞治疗逐渐被批准进入临床实验，目前发现干细胞治疗能够明显改善心肌梗死后心脏功能，但也面临诸多问题与舆论压力，例如干细胞移植具有致畸作用、排斥反应等危害，并且面临恶劣微环境的移植细胞定植率低、存活率低等难题。

Lai等[6]首次将人胚胎干细胞来源的MSCs条件培养液注射至急性心肌梗死动物模型中，发现可显著改善心肌梗死后后心脏功能且心肌梗死面积明显减小，这说明了干细胞治疗缺血性心肌病可能并非通过干细胞的迁移、增殖、分化过程起作用，而是通过分泌某些效应分子影响心肌梗死区域内源性细胞起心脏修复作用。为进一步探讨其潜在机制，该团队从培养液中提取出一种膜性囊泡并对其进行鉴定，最后将其命名为外泌体。该项研究为心肌梗死后干细胞的非细胞治疗策略奠定了重要的理论及实验基础。

随后越来越多干细胞研究学者将眼光移向外泌体，研究发现多种干细胞、成熟细胞都具有旁分泌外泌体特性，且外泌体很可能是细胞与细胞间传递信号的载体。心肌细胞面临应激环境可分泌含特定遗传信息的外泌体，干细胞将外泌体内化后诱导其表型定向重组以适应应激；而干细胞也可分泌外泌体，致损伤心肌细胞中抗凋亡基因上调、促凋亡基因下调，从而抑制损伤心肌细胞凋亡、促进心肌细胞增殖及心肌梗死区域血管新生。简而言之，损伤心肌细胞与干细胞间信息交流是双向的。那么，干细胞来源的外泌体是如何促进心肌梗死后心脏修复的呢，可能主要通过以下机制起作用。

2.1 外泌体促进心肌细胞存活 正常条件下，功能性心肌细胞中三磷酸腺苷(ATP)的合成主要通过脂肪酸β氧化磷酸化产生，然而在缺血缺氧环境下，心肌细胞氧化磷酸化途径受抑制，ATP生成急剧减少，严重制约了ATP依赖性的离子泵、基因转录、蛋白合成等诸多生物途径进程，最终可导致心肌细胞功能异常甚至细胞凋亡。有学者在研究糖尿病性心脏病的过程中发现[7]，无糖预处理心肌细胞可促进心肌细胞通过旁分泌途径分泌外泌体。心肌细胞来源的外泌体被内皮细胞内化后，将大量促进糖转运及糖酵解相关信息分子传递至内皮细胞内，促进内皮细胞内丙酮酸合成，进而提高氧化应激状态下内皮细胞的应激阈。虽然该研究主要是糖尿病性心脏病个体的心肌细胞来源的外泌体作用于内皮细胞，然而我们不难推测，在缺血性心肌病个体中损伤心肌细胞也可能借助外泌体作为载体将促糖转运及糖酵解相关信息分子传递至梗死边缘区心肌细胞，进而促进应激状态下心肌细胞糖酵解途径、发挥心脏保护作用。

众所周知，在缺血缺氧条件下，ATP严重不足，钙调节异常、钙超载形成，最终可导致细胞凋亡。miRNA-199a/214家族是缺氧诱导型miRNAs重要组成部分，在心肌缺血及心力衰竭状态下呈高表达水平[8]。研究表明，EPCs所分泌的外泌体中富含miRNA-214[9]，Aurora等[10]也报道，miRNA-214可通过调节心肌细胞钙平衡相关基因表达，如钠钙交换蛋白1、细胞死亡调节子、钙调节蛋白Ⅱdeta、亲环素D等，进而抑制钙超载，进一步研究发现，miRNA-214还可能通过调控PTEN/PI3K/Akt信号通路对抗氧化应激状态下心肌细胞损伤[11]。此外，过表达GATA4的MSCs来源外泌体通过上调miRNA-19a激活Akt及Erk信号通路起到心肌细胞保护作用[12]。

Nakazato等[13]发现在氧化应激状态下心脏组织内源性纤维母细胞来源外泌体可经PKC信号通路调控心肌细胞线粒体ATP敏感性钾离子通道，发挥心肌保护作用，增加心肌细胞存活率。此外，CPCs来源外泌体通过抑制凋亡执行因子Caspase 3/7活化，进而抑制心肌细胞凋亡[14]。

2.2 外泌体促进内皮细胞增殖、迁移及血管新生 尽管干细胞移植治疗对处于氧化应激状态下的心肌细胞保护作用显著，然而急性心肌梗死后心肌梗死边缘区仅有极少数细胞存活。心脏缺血性损伤后，心肌细胞凋亡/死亡、心脏代偿/修复，终将导致心室重塑、心梗区瘢痕形成，那么促进梗死区域血管新生的干细胞效应显得尤为重要。

成年哺乳动物心脏中含有固有CPCs/CSCs,具有与心脏细胞相似的遗传背景[15]。CPCs源外泌体可促进内皮细胞迁移，并且通过上调miRNA-132及miRNA-146a促进人脐静脉内皮细胞管腔形成[14]。miRNA-146与TGF-β协同作用抑制p120RasGAP表达，随后Ras通路活化，导致内皮细胞发生表型转换[16]；另外miRNA-146a还能通过抑制CARD10进而激活NF-κB信号通路[17]。除了miRNA-132及miRNA-146a参与内皮细胞迁移及血管形成进程外，miRNA-320、miRNA-31等亦参与其中，有研究表明，心肌细胞源性外泌体中miRNA-320与miRNA-216产生拮抗效应，被内皮细胞内化后通过平衡IGF-1, Hsp20及Ets-2信号通路，进而调节内皮细胞增殖及血管新生等生物学进程；脂肪MSCs来源的外泌体通过miRNA-31上调缺氧诱导因子-1α平，促进人脐静脉内皮细胞迁移及管腔形成。此外，外泌体中还携带大量效应蛋白，如促进细胞外基质金属蛋白酶诱导因子合成、活化NF-κB信号通路，进而促进内皮细胞迁移及血管形成。

除了CSCs源性外泌体具有促进细胞迁移、血管新生效应外，多种干细胞来源的外泌体亦有相似作用。Bian等通过缺氧预处理MSCs促进外泌体分泌，将外泌体注射进急性心肌梗死动物模型中发现梗死边缘区毛细血管密度增加，体外研究进行验证，发现缺氧预处理的MSCs源性外泌体可促进人脐静脉内皮细胞血管形成，新近亦有报道称EPCs源性外泌体也具有EPCs促血管的新生效应[9]。

多数哺乳动物细胞可分泌外泌体，包括干细胞、体细胞、肿瘤细胞等，它存在于多种体液中，细胞与细胞间以外泌体为载体进行信息交流。越来越多的实验研究及临床应用已证实多种干细胞的外泌体可被靶细胞内化后，改变其生物学进程，进而保护急性缺血缺氧的心脏。近些年，虽然干细胞移植治疗日益成熟，但仍无法避免人伦舆论压力及致畸致瘤、免疫排斥反应、肺栓塞等危害以及移植率、存活率低等难题，并且干细胞移植后还需进行常规药物治疗，最终无法区分干细胞治疗与药物治疗为心脏功能改善贡献孰重孰轻。

近些年，在心肌梗死后心脏再生医学研究领域中干细胞源性外泌体研究热度持续升温。大量研究表明，不同种类来源的外泌体具有干细胞相似效应，可通过促进促进细胞迁移、促进血管新生、抗细胞凋亡、抗炎症等效应。在心肌细胞间、心肌层间以及心肌组织与其他组织间，外泌体作为重要的细胞间信息交流媒介参与细胞的各种生物学进程。外泌体根据其不同细胞来源可携带细胞特异性信息分子(包括蛋白因子、miRNAs、lncRNAs、脂质体以及基因片段)以及特异性膜受体，并且对低渗微环境耐受，可在细胞间高效传递信息，其作为心肌梗死后干细胞非细胞治疗新策略无可厚非。

临床推广前需解决的问题可能为：①干细胞来源是否符合伦理及其获取的难易程度；②如何从干细胞中获取大量外泌体，如缺氧诱导、基因修饰及表观遗传修饰等；③目前外泌体提取技术多为超速离心法或试剂盒法，需挖掘高效且快速提取的新方法；④外泌体内成分复杂，需进一步了解各种效应成分之间的作用及其机制；⑤即便大量临床前实验已证明外泌体治疗缺血性心肌病的安全性，但仍需进一步考察，如外泌体干预后畸胎瘤的发生等。总之，虽然外泌体在动物研究中取得了巨大成果，但若将其向临床推广还需要大量基础及临床研究进一步探索。

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