藏药宽筋藤HPLC指纹图谱研究※

● 朱小芳 谢一辉 马亚娟 白文婷 平欲晖 黄丽萍

宽筋藤为防已科植物中华青牛胆Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的干燥茎藤，藏药名为勒哲，又名大接筋藤、松根藤、舒筋藤、牛挣藤、大松身，广泛分布于广西、广东、西藏、云南、海南等地区[1-2]，其味微苦，性寒，归肝经，主要有舒筋通络，祛风止痛之功能，用于腰肌劳损，风湿痹痛，跌打损伤等[3]。该属植物的块根、藤茎常作为中药入药。近年来，在藏药质量管理中出现的多种问题，如基原不统一或不清楚[4]，药用部位不清楚，药名混乱，同名异源或应用混乱[5]等。目前藏药宽筋藤在质量控制上还没有一种系统性的监测方法，为此本文试图建立其HPLC指纹图谱，为产品的质量控制奠定基础。

1 仪器与材料

1.1仪器旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国Agilent有限公司)，Sartoris BS214-D型电子天平(德国赛托利斯仪器有限公司)，Milli-Q超纯水仪(江西鼎技科学仪器有限公司)，B-260恒温水浴锅(上海亚荣生化仪器厂)，SHZ-III循环水真空泵(巩义市予华仪器有限公司)，KQ-50E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，AE-240型十万分之一电子天平(瑞士梅特勒公司)，FZ102微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.2试剂甲醇，乙腈，甲酸均为色谱级(美国ACS公司)，水为Milli-Q超纯水仪制备，其他试剂均为分析纯。

1.3试药丁香苷、Tinoscorside D、3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品，为本实验室分离得到，通过碳氢谱和质谱数据等确定它们的结构，纯度经HPLC面积归一化法检测大于98%。

1.4样品本实验药材由西藏医学院格桑次仁副教授采购，共8批宽筋藤样品，经西藏医学院格桑B次仁副教授鉴定为防己科植物青牛胆属中华青牛胆Tinosporasinensis(Lour.)Merr.的藤茎。见表1。

表1 药材来源

续表1

样品采集地点采集时间S6藏医学院藏药厂2016.04S7西藏2015.05S8新疆乌鲁木齐2016.08

2 方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：Spursil C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脱(0-15min3%A;15-40min，3%-13%A;40-60min，13%-13%A;60-68min，13%-18%A;68-83min，18%-18%A;83-90min，18%-20%)，检测波长为272nm，柱温25℃，流速为1ml/min，进样量为10μL。

2.2对照品溶液的制备取丁香苷、Tinoscorside D、3，4-dimethoxyphenyl-O-β-D-apiofuranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside的对照品约2.0mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解定容。即得对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取宽筋藤粉末2.0g(过二号筛)，精密称定，加入60%甲醇20ml，回流提取3次，每次20min，合并滤液，回收试剂浓缩至干，用甲醇溶液超声溶解并定容至10ml，过0.22μm膜，即得到供试品溶液。

2.4方法学考察为了分析方法的可行性，以西藏拉萨市场采集的宽筋藤药材为研究对象，对其精密度，稳定性和实验方法的重复性进行相应考察，选择保留时间为40.7min左右的色谱峰为参照峰，计算HPLC色谱图中色谱峰的相对保留时间和相对峰面积。

2.4.1 精密度试验 取宽筋藤药材，按2.3方法制备同一供试品溶液，按2.1色谱条件连续进样6次，考察仪器的精密度，测得相对峰面积和相对保留时间。结果显示，相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，所用仪器的精密度良好。结果见表2和表3。

表2 相对保留时间精密度实验

表3 相对峰面积精密度实验

2.4.2 稳定性试验 取宽筋藤药材，按2.3法制备同一供试品溶液，依照2.1色谱条件，分别在0h，2h，4h，8h，16h，24h测定，记录色谱图，测得相对保留时间和相对峰面积。结果显示(见表4和表5)相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%，供试品溶液在24h内稳定。

表4 相对保留时间稳定性实验

表5 相对峰面积稳定性实验

2.4.3 重复性试验 取宽筋藤药材2.0g，精密称定，共6份，按2.3法制备同一供试品溶液，按2.1色谱条件进样分析。结果显示(见表6和表7)，样品制备方法重复性好，符合指纹图谱的要求测得相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%。

表6 相对保留时间重复性实验

表7 相对峰面积重复性实验

2.5藏药宽筋藤药材指纹图谱分析

2.5.1 藏药宽筋藤药材指纹图谱的采集 取不同产地，不同采收时间的宽筋藤药材，按2.3法制备供试品溶液，按2.1色谱条件进样分析。根据色谱图，并对其色谱图进行积分，同时标定14个共有峰。所选择的共有峰可以较全面的体现出宽筋藤中极性部位化学成分的信息。通过安捷伦化学工作站输出不同产地药材的HPLC色谱图。

2.5.2 藏药宽筋藤药材的指纹图谱相似度分析 根据国家药典委员会制定的《中国色谱指纹图谱相似度评估系统》(2010版)对不同产地，不同采收时间的宽筋藤药材指纹图谱数据进行分析，宽筋藤药材指纹图谱的相关参数进行了自动匹配，标定了14个共有峰，同时给出了对照指纹图谱图1，将各样品和对照指纹图谱进行比较，计算各产地宽筋藤药材提取物指纹图谱的相似度。不同产地指纹图谱见图2，指纹图谱相似度结果见表8。

图1 宽筋藤对照指纹图谱

图2 不同产地宽筋藤高效液相指纹图谱

S1S2S3S4S5S6S7S8对照指纹图谱S110.860.7810.750.8790.880.8510.8140.896S20.8610.9530.8070.9130.9540.9570.9170.98S30.7810.95310.6270.8020.9630.9740.8250.905S40.750.8070.62710.8870.6720.6610.9260.885S50.8790.9130.8020.88710.8490.8520.9140.957S60.880.9540.9630.6720.84910.9760.8410.932S70.8510.9570.9740.6610.8520.97610.8370.929S80.8140.9170.8250.9260.9140.8410.83710.965对照指纹图谱0.8960.980.9050.8850.9570.9320.9290.9651

2.5.3 指纹图谱中色谱峰的化学指认 用化学结构已被鉴定的部分化合物做对照，对照指纹图谱中部分共有指纹峰进行确认，通过保留时间和图谱，确认8号峰为3，4-二甲氧基苯基-O-β-D-呋喃芹糖基(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，9号峰为丁香苷，10号峰为Tinoscorside D。

3 讨论

本实验对提取溶剂种类与方式、体积分数、料液比、时间均进行了考察，对比了甲醇、乙醇，超声、回流两种方式所得供试品溶液的指纹图谱，结果表明：甲醇回流>乙醇回流>甲醇超声>乙醇超声，故选择甲醇回流法进行提取。比较了体积分数40%，60%，80%，100%甲醇所提取的供试品溶液图谱，结果表明甲醇浓度为40%和100%浓度提取出的色谱峰少，而且峰面积偏低；甲醇浓度为60%和80%时，色谱峰数量以及峰面积相差不大，故从色谱峰数量，峰面积以及溶剂成本多方面考虑，选择60%甲醇溶液为提取溶剂。分别考察了料液比为1∶10，1∶15，1∶20，1∶25后的供试品溶液图谱，发现不同的料液比对于宽筋藤提取液的影响甚小，从节约成本等方面考虑，本实验的料液比选择1∶10。分别考察了回流提取20min，40min，60min后的供试品溶液图谱，结果表明：从峰数量上看，不同提取时间所得到峰数量几乎相同；从峰面积和峰型上看，提取20min最佳。故本实验选择提取时间为20min。

用乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行洗脱条件的考察，反复调整流动相比例后，确定洗脱比例，采用DAD检测器在190-400nm处进行紫外吸收全波段扫描，并获取不同波长下的数据(210，254，272nm，280，323，365nm)，对于指纹图谱的确认必须遵循信息量最大化的原则，结果显示，272nm下色谱峰的数量较多且分离度较好。故选择272nm下作为指纹图谱的检测波长。

本实验的结果表明8批宽筋藤药材的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%。通过《中国色谱指纹图谱相似度评估系统》(2010版)计算出8批药材的相似度均大于0.8，符合指纹图谱的分析要求。表明HPLC指纹图谱方法可作为藏药宽筋藤质量控制的检测方法。一方面通过比较图谱，可以直观看出各共有峰的比例变化，来判断产品质量的变；另一方面也可以通过测定各峰峰面积对活性指标成分进行定量。本实验所建立的HPLC指纹图谱可以有效分析和监测其质量。

[1]全国中草药汇编编写组.全国中草药汇编[M].上册.北京：人民卫生出版社，1978：652.

[2]广东中药志编辑委员会．广东中药志[M]．广州：广东科技出版社，1994：501-502．

[3]广东省食品药品监督管理局.广东省中药材标准(第一册)[S].广州：广东科技出版社，2004：183.

[4]钟国跃，周福成，石上梅，等.藏药材常用品种及质量标准现状调查分析研究[J].中国中药杂志，2012，37(16)：2349-2355.

[5]国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草：藏药卷[M].s上海：上海科学技术出版社，2002.