超高效液相色谱-串联质谱法分析柑橘及土壤中苦参碱残留

沈沛霖，钱 圆，卫严冰，王蒙岑，朱国念

(浙江大学 农药与环境毒理研究所，浙江 杭州 310058)

苦参碱是从苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)、苦参(SophoraflavescensAit)、广豆根(SophorasubprostrataChun et T.Chen)、山豆根(SophoratongkinensisGapnep)等槐属植物的根、茎中提取得到的水溶性总碱，是多种生物碱的总称，具有较为广泛的医用和农用活性[1]。

苦参碱纯品为白色粉末，相对密度1.16，熔点77 ℃，分子式为C15H24N2O，其相对分子质量为248.37。苦参碱属于天然植物源农药，对人畜低毒，是广谱杀虫剂，兼具触杀和胃毒作用，其杀虫机理是使害虫神经中枢麻痹，从而导致虫体蛋白质凝固、气孔堵塞，最后窒息而死。此外，在持效期内，苦参碱还具有趋避作用，可有效减少害虫对作物的危害。由于苦参碱作用于害虫神经中枢，故其后代产生抗药性的可能性大大降低[2]，对各种作物上的菜青虫、茶小绿叶蝉、红蜘蛛、茶尺蠖、小菜蛾等害虫有明显的防治效果[3-5]。同时，苦参碱兼具杀菌抑菌作用，对炭疽病、赤霉病、疫霉病、灰霉病的病原菌也具有一定的抑制作用[6-8]。

近年来，苦参碱在柑橘园中大量应用，而且在未来的应用也会更为广泛。目前，国内外虽有部分学者对苦参碱的残留分析方法进行了报道，但多采用传统的色谱法进行分析检测，灵敏度和准确度相对较低。因此，笔者利用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(UPLC-ESI-MS/MS)建立了一套快速、灵敏、可靠的残留分析方法以检测柑橘及土壤样品中的苦参碱残留，为苦参碱的生态及膳食风险评估提供了有效的分析方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试柑橘品种为南丰密橘，柑橘和土壤样品均采自江西省南昌市江西农大柑橘生态园，土壤类型为黄红壤，pH值为6.0。苦参碱标准品(纯度98.0%，大连美仑生物技术有限公司)。

超高效液相色谱-质谱联用仪UPLC-ESI-MS/MS (Waters)；色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 m×100 mm，1.8 μm)；高速匀浆机、高速离心机、旋转蒸发仪(RE-2000)、N-EVAP 11氮吹仪(杭州尔力公司)。流动相乙腈、甲酸为色谱纯；硫酸镁、氯化钠、无水硫酸钠、PSA、乙酸乙酯、甲酸等试剂均为分析纯。

1.2 分析方法

1.2.1 样品的提取与净化

QuEChERS法提取。土壤、橘肉、橘皮、全果：称取制备好的样品20 g于250 mL离心瓶中(橘皮和全果样品加入20 mL去离子水)，加入50 mL乙腈，匀浆2 min，225 r·min-1振荡30 min，过滤至装有6 g NaCl、8 g MgSO4·7H2O的具塞量筒，剧烈振荡1 min，静置30 min，吸取40 mL上层溶液于梨形瓶中，浓缩近干，氮气吹干，待净化。

PSA净化。向上述梨形瓶中加入2 mL色谱乙腈定容，转移至装有100 mg PSA和200 mg无水硫酸镁的离心管中，涡旋净化1 min，在超高速离心机中以10 000 r·min-1离心3 min，过0.22 μm有机膜，UPLC-MS/MS待测。

1.2.2 UPLC-MS/MS分析条件

样品采用超高效液相色谱串联质谱法检测，UPLC采用梯度洗脱。具体过程为：0～1.5 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(2/98，V/V)；1.5～2.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(70/30，V/V)；2.0～4.0 min，流速0.30 mL·min-1，乙腈-0.1%甲酸水(80/20，V/V)。

柱温40 ℃，流速0.30 mL·min-1，进样量5 μL。质谱采用ESI(电喷雾离子源)正源多重反应监测(MRM)模式，毛细管电压3.0 KV，锥孔电压30 V，离子源温度120 ℃，脱剂温度350 ℃，脱溶剂气流量650 L·h-1，锥孔气流量50 L·h-1。苦参碱保留时间为2.64 min，定性离子对(m/z)250.07/149.61，定量离子对(m/z)250.07/149.61和250.07/177.73；滞留时间0.2 s，碰撞能量35 eV

1.2.3 标准曲线的绘制

将1.0 mg·mL-1的苦参碱标准溶液用乙腈稀释配得0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1系列标准溶液，再用空白样品提取液稀释成浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2 mg·L-1的标准工作液在上述UPLC-MS/MS条件下进行测定，采用外标法定量，以进样浓度为X轴、响应值为Y轴得到标准工作曲线。

1.2.4 残留计算公式

苦参碱残留量(mg·kg-1)=[进样样品检出量(mg)×定容体积(mL)]/[进样量(mL)×样品重量(kg)]

2 结果与分析

2.1 方法的灵敏度及标准曲线

在优化后的分析条件下进行测定，苦参碱的保留时间约为0.79 min，仪器的最小检出量为5×10-12g。在0.1～2 mg·L-1范围内的苦参碱的仪器响应值均与浓度呈良好线性关系(表1)。

表1 不同样品的标准工作曲线

2.2 方法的准确度与精密度

取全果、橘肉、橘皮和土壤样品(各20 g)，添加系列浓度的苦参碱标准溶液进行回收率试验，每浓度处理重复5次(表2)。苦参碱在4种基质样品中的平均回收率为77.7%～100.0%，说明方法的准确度和精密度均符合农药残留分析的要求。

表2 苦参碱在全果、橘肉、橘皮和土壤中的 平均添加回收率

3 小结与讨论

目前，关于苦参碱残留分析方法的研究报道较少，且多采用传统色谱方法进行检测分析。孙杨等[9]使用无水乙醇超声提取黄瓜和土壤中的苦参碱，并使用气相色谱分析方法表明，黄瓜和土壤中苦参碱的最小检出量均为1.36×10-12g，最低检出浓度为0.004 mg·kg-1(黄瓜)、0.008 mg·kg-1(土壤)。郝佳等[10]采用C18固相萃取-高效液相色谱分析方法，研究了苦参碱在小白菜及土壤中的残留和消解动态表明，苦参碱在小白菜与土壤中的定量限(LOQ)均为0.02 mg·kg-1。陈红平等[11]建立了茶叶中苦参碱残留检测的2种前处理方法，比较了液相色谱-串联质谱与气相色谱-串联质谱检测茶叶中苦参碱残留量分析方法的适用性。杨方等[12]建立了液相色谱-串联质谱同时检测水产品中苦参碱与鱼藤酮残留的方法，其中苦参碱的检出限为0.86 mg·kg-1。与之前报道的方法相比较，笔者所建立的方法利用QuEChERS法提取和N-丙基乙二胺(PSA)净化，使前处理时间得到有效缩短，且净化效果理想，同时结合UPLC-ESI-MS/MS检测，使方法的灵敏度和准确度得到了一定的提高。

在质谱条件优化中，分别用正、负离子模式进行母离子全扫描，对比结果，得到正离子模式的响应较高，因此选择正离子检测模式。通过调节碰撞电压发现苦参碱在碰撞电压35 eV时碎片离子较少，且主要特征子离子碎片丰度达到最大，极大提高了目标的分析灵敏度。在流动相条件优化中，比较了乙腈、甲醇、水在不同组合和配比下对分离度的影响，结果表明，在乙腈-水体系中峰形尖锐对称，同时在加入甲酸后，峰形更佳。因此，确定乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相。此外，对锥孔电压等其他参数也进行了优化，并通过基质加标消除基质效应，使检测条件达到最佳。

笔者利用UPLC-MS/MS建立了一套柑橘中苦参碱残留的分析方法，并通过简化前处理步骤，优化检测条件等方法提高了操作的简便性和检测的灵敏度。添加回收率试验结果也表明，该方法符合残留检测的分析要求。综上所述，所建立的分析方法能够用于有效检测柑橘及土壤中苦参碱的痕量残留，为进一步的生态和膳食风险评估提供了重要的方法依据。

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