补肾活血方对肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠子宫内膜容受性的影响研究

尹晓丹，何军琴，王景尚，薛晓鸥

子宫内膜对于维持女性月经和生育能力非常重要，在胚胎着床和妊娠过程中起关键作用。子宫内膜容易受流产、感染等因素的影响而形成薄型子宫内膜。薄型子宫内膜是指子宫内膜厚度低于能够获得妊娠的阈厚度，即＜7 mm［1］。目前治疗薄型子宫内膜常用的药物有雌激素、阿司匹林等［2-5］，但疗效不确定［6-9］，因此寻找更有效的治疗方案是目前临床亟待解决的问题。

评价子宫内膜容受性的指标有子宫内膜厚度、形态学、间质、腺体以及子宫内膜血管等，这些指标均与妊娠结局有很大的关系。本研究旨在观察补肾活血方对肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠子宫内膜容受性的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 2016年6月—2017年3月选取SPF级雌性SD大鼠42只，体质量200～220 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001。动物适应环境3 d，自由饮水饮食，室温（22±1）℃，湿度（40±10）%，光照周期12 h/12 h。

1.2 实验药物 实验用中药购自同仁堂药店。补肾活血方由熟地15 g、菟丝子12 g、桑寄生12 g、覆盆子12 g、川断12 g、川牛膝12 g、当归12 g、丹参12 g、泽兰12 g、川芎9 g、益母草20 g、鸡血藤12 g、红花9 g组成，药物浸泡后煎煮。一剂药煎煮2次，第一次煎煮先用大火煮沸后改用小火，再煎

本文创新点：

（1）本文为薄型子宫内膜的临床防治和补肾活血治疗提供了新思路；（2）首次叠加了肾虚血瘀模型和薄型子宫内膜模型；（3）通过相关作用机制的研究，为中药治疗薄型子宫内膜的推广提供实验依据。25 min，将药液煎至100 ml左右滤出。第二次煎煮加凉水稍高于药面，煮沸后再改用小火煎15 min左右，煎至100 ml左右滤出。将两次煎煮的药液混合均匀，再浓缩或稀释到所需浓度。按人鼠体表面积换算，大鼠剂量为人的等效剂量；戊酸雌二醇（补佳乐，1 mg/片，拜耳公司，批号：J20130009），按人鼠体表面积换算，大鼠剂量为0.3 mg·kg-1·d-1；羟基脲（齐鲁制药有限公司，批号H37021289），按人鼠体表面积换算，大鼠剂量为450 mg·kg-1·d-1；高分子右旋糖酐（Dextran70，瑞士Amwesham Biosciences公司），按人鼠体表面积换算，大鼠剂量为5 ml/kg。

1.3 主要试剂 苏木精染液、伊红染液、生物素标记的山羊抗兔IgG、辣根酶标记链霉卵白素（均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司），波形蛋白一抗、角蛋白一抗（购自Abcam公司）。

1.4 动物模型制备 将大鼠随机分为对照组9只，造模组33只。参照《雌性大鼠肾虚血瘀模型初探》［10］建立肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠模型。造模组大鼠给予羟基脲450 mg·kg-1·d-1灌胃给药8 d，于末次给药30 min后尾静脉快速推注10%高分子右旋糖苷5 ml/kg。羟基脲给药8 d后，大鼠出现皮毛枯槁欠光泽、体型瘦小等肾虚症状；注射10%高分子右旋糖苷1 h后大鼠耳、爪、尾部颜色紫暗，提示肾虚血瘀造模成功。将肾虚血瘀模型大鼠腹部皮肤切开，进入腹腔定位子宫后，在宫角处注入0.3 ml 95%无水乙醇，保持宫腔充盈状态，2 min后再次注入0.3 ml 95%无水乙醇，另一侧操作相同，反复冲洗宫腔，关腹。造模结束后，分别从对照组和造模组随机抽取3只大鼠处死，开腹取子宫，观察子宫大体标本，并纵行剖开部分子宫暴露宫腔后浸入10%福尔马林溶液中固定，常规HE染色后，在光镜下观察子宫内膜厚度。与对照组相比，模型组子宫壁全层变薄，子宫内膜层较肌层更明显，且未见明显波浪形，验证模型造模成功。

1.5 动物分组及用药 将造模组大鼠随机分为模型组、补肾活血高剂量组、补肾活血中剂量组、补肾活血低剂量组、补佳乐组，每组6只。对照组灌服蒸馏水10 ml/kg；模型组灌服蒸馏水10 ml/kg；补肾活血低剂量组灌服补肾活血方2.16 mg/kg，10 ml/d；补肾活血中剂量组灌服补肾活血方4.32 mg/kg，10 ml/d；补肾活血高剂量组灌服补肾活血方8.64 mg/kg，10 ml/d；均为1次/d；补佳乐组灌服补佳乐0.3 mg·kg-1·d-1。给药3个动情周期即15 d。

1.6 实验方法 第15天给药后1 h取材（开腹取子宫）。

1.6.1 HE染色 常规HE染色后，在光镜下观察子宫内膜各层厚度变化、腺体和血管分布情况，采用Leica qwin plus图像处理软件测量子宫内膜厚度、间质厚度。

1.6.2 免疫组化法检测子宫内膜上皮细胞面积、间质细胞面积 锐性刮取子宫后壁内膜全层1 cm×1 cm，标本冷藏运送并在20 min内经机械分离和酶消化制成细胞悬液，然后通过二次筛网过滤法（100 μm和40 μm的滤筛）初步将基质细胞和上皮细胞分离，然后分别用有限稀释法进行低密度培养，角蛋白和波形蛋白特异表达于上皮细胞和间质细胞，因此本研究利用角蛋白和波形蛋白的面积来反映上皮细胞和间质细胞的生长情况。

1.7 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示,多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子宫内膜HE染色结果 对照组子宫内膜结构完整，呈波浪形，腺上皮和腔上皮细胞完整，呈立方状，腺体和血管数量正常；模型组子宫内膜厚度变薄，腺上皮和腔上皮细胞呈扁平状，腺体稀少，毛细血管数量减少，内膜连续性差；补肾活血低、中剂量组子宫内膜结构欠完整，腺上皮及腔上皮细胞呈矮柱状，腺体减少，毛细血管增多，内膜稍厚；补肾活血高剂量组、补佳乐组结构完整内膜比例增加，内膜连续，呈波浪形，大部分腺上皮和腔上皮细胞完整，呈单层立方状，排列整齐（见图1）。

2.2 各组大鼠子宫内膜厚度比较 6组大鼠子宫内膜厚度比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫内膜厚度小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血低、中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫内膜厚度大于模型组，差异有统计学意义（p＜0.05）；补佳乐组大鼠子宫内膜厚度大于补肾活血低、中、高剂量组，差异有统计学意义（p＜0.001，见表1）。

2.3 各组大鼠子宫间质厚度比较 6组大鼠子宫间质厚度比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫间质厚度小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血低、中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫间质厚度大于模型组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补佳乐组大鼠子宫间质厚度大于补肾活血低、中剂量组，差异有统计学意义（p＜0.05，见表2）。

图 1 各组大鼠子宫内膜形态（HE染色，×40）Figure 1 Endometrial morphology in rats of each group

2.4 各组大鼠子宫腺体数比较 6组大鼠子宫腺体数比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫腺体数少于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫腺体数多于模型组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补佳乐组大鼠子宫腺体数多于补肾活血低剂量组，差异有统计学意义(p＜0.001，见表3）。

2.5 各组大鼠子宫血管数比较 6组大鼠子宫血管数比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫血管数少于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫血管数多于模型组，差异有统计学意义（p＜0.05）；补佳乐组大鼠子宫血管数多于补肾活血低剂量组，差异有统计学意义(p＜0.05，见表4）。

2.6 各组大鼠子宫内膜上皮细胞面积比较 6组大鼠子宫内膜上皮细胞面积比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫内膜上皮细胞面积小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫内膜上皮细胞面积大于模型组，差异有统计学意义（p＜0.05）；补佳乐组大鼠子宫内膜上皮细胞面积大于补肾活血低剂量组、小于补肾活血高剂量组，差异有统计学意义（p＜0.05，见表5）。

2.7 各组大鼠子宫内膜间质细胞面积比较 6组大鼠子宫内膜间质细胞面积比较，差异有统计学意义（p＜0.05）。模型组大鼠子宫内膜间质细胞面积小于对照组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补肾活血低、中、高剂量组及补佳乐组大鼠子宫内膜间质细胞面积大于模型组，差异有统计学意义（p＜0.001）；补佳乐组大鼠子宫内膜间质细胞面积大于补肾活血低剂量组、小于补肾活血高剂量组，差异有统计学意义(p＜0.001，见表 6）。

3 讨论

薄型子宫内膜通常是指在黄体中期（排卵后6～10 d）子宫内膜厚度＜7 mm，其主要临床特征为月经周期正常，但月经量过少。薄型子宫内膜不仅影响胚胎种植，还增加自然流产的风险，同时也是导致不孕及闭经的重要因素，给患者带来极大心理压力，因此，对薄型子宫内膜的发病机制与防治研究成为了国内外的难点与热点课题。本研究拟通过建立肾虚血瘀薄型子宫内膜大鼠模型来探讨补肾活血方对其子宫内膜组织形态学和细胞学的影响。结果提示，补肾活血方能够改善子宫内膜的结构，在子宫内膜的厚度、间质厚度、腺体数以及血管数方面均有所提高。补肾活血方由熟地15 g、菟丝子12 g、桑寄生12 g、覆盆子12 g、川断12 g、川牛膝12 g、当归12 g、丹参12 g、泽兰12 g、川芎9 g、益母草20 g、鸡血藤12 g、红花9 g组成。补肾填精、养血活血是中医改善薄型子宫内膜的常用治法，补肾活血方基于以上理论，多年来经临床反复验证能有效改善薄型子宫内膜［11］。临床上除了采用药物治疗薄型子宫内膜，也可以采用子宫内膜搔刮术来激发内膜的炎性反应和免疫反应，刺激内膜分泌相应的细胞因子和生长因子等［12］，从而增加子宫内膜容受性。此类方法虽然能够改善子宫内膜容受性，但也有导致妇科炎症等风险。

表 1 各组大鼠子宫内膜厚度比较（，μm）Table 1 Comparison of the endometrial thickness between rats of each group

表 1 各组大鼠子宫内膜厚度比较（，μm）Table 1 Comparison of the endometrial thickness between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05；与补肾活血中剂量组比较，dp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，ep＜0.05

对照组 6 23.6±4.3模型组 6 9.3±0.7a补肾活血低剂量组 6 11.6±0.3b补肾活血中剂量组 6 13.0±0.5b补肾活血高剂量组 6 14.6±1.0b补佳乐组 6 18.1±0.8bcde F值 45.792 P值 ＜0.001

表 2 各组大鼠子宫间质厚度比较（，μm）Table 2 Comparison of the thickness of uterine stroma between rats of each group

表 2 各组大鼠子宫间质厚度比较（，μm）Table 2 Comparison of the thickness of uterine stroma between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05；与补肾活血中剂量组比较，dp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，ep＜0.05

对照组 6 678.8±49.3模型组 6 154.3±21.1a补肾活血低剂量组 6 370.6±53.8b补肾活血中剂量组 6 471.2±26.0b补肾活血高剂量组 6 577.6±25.3b补佳乐组 6 522.3±12.8bcde F值 165.963 P值 ＜0.001

表 3 各组大鼠子宫腺体数比较（，个）Table 3 Comparison of the number of uterine glands between rats of each group

表 3 各组大鼠子宫腺体数比较（，个）Table 3 Comparison of the number of uterine glands between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05

对照组 6 36±7模型组 6 14±4a补肾活血低剂量组 6 14±3补肾活血中剂量组 6 24±2b补肾活血高剂量组 6 32±10b补佳乐组 6 30±6bc F值 15.312 P值 ＜0.001

表 4 各组大鼠子宫血管数比较（，个）Table 4 Comparison of uterine vessels between rats of each group

表 4 各组大鼠子宫血管数比较（，个）Table 4 Comparison of uterine vessels between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05

对照组 6 28.2±4.3模型组 6 16.3±2.2a补肾活血低剂量组 6 17.3±1.4补肾活血中剂量组 6 21.7±2.2b补肾活血高剂量组 6 21.8±2.3b补佳乐组 6 21.8±1.8bc F值 16.666 P值 ＜0.001

表 5 各组大鼠子宫内膜上皮细胞面积比较（，μm2）Table 5 Comparison of endometrial epithelial cell area between rats of each group

表 5 各组大鼠子宫内膜上皮细胞面积比较（，μm2）Table 5 Comparison of endometrial epithelial cell area between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05；与补肾活血高剂量组比较，dp＜0.05

对照组 6 22.8±2.6模型组 6 6.8±1.4a补肾活血低剂量组 6 6.8±0.5补肾活血中剂量组 6 8.5±0.6b补肾活血高剂量组 6 15.0±0.6b补佳乐组 6 9.4±0.5bcd F值 145.854 P值 ＜0.001

表 6 各组大鼠子宫内膜间质细胞面积比较（，μm2）Table 6 Comparison of endometrial stromal cell area between rats of each group

表 6 各组大鼠子宫内膜间质细胞面积比较（，μm2）Table 6 Comparison of endometrial stromal cell area between rats of each group

注：与对照组比较，ap＜0.05；与模型组比较，bp＜0.05；与补肾活血低剂量组比较，cp＜0.05；与补肾活血高剂量组比较，dp＜0.05

对照组 6 11.1±1.0模型组 6 2.6±0.5a补肾活血低剂量组 6 5.0±0.3b补肾活血中剂量组 6 7.9±1.2b补肾活血高剂量组 6 13.7±0.8b补佳乐组 6 7.1±1.2bcd F值 116.054 P值 ＜0.001

中医学古籍中没有对“薄型子宫内膜”的记载。薄型子宫内膜的临床表现主要为不孕，故中医治疗本病多归结为“不孕”。中医学认为，肾藏精，生天癸，主生殖，为冲任之本，育胎之根。若先天禀赋不足，肾气虚弱，失于温煦气化，或早配频产，以致耗伤精血，则天癸不充，肾封藏失职，冲任二脉失养，胞脉失养而不能摄精受孕。女子以血为本，血气贵在流畅。七情内伤，素性抑郁，或忿怒过度，气滞血瘀，瘀阻冲任，气血运行受阻，种子艰难。又或流产金刃伤及胞宫胞脉，使胞宫受损，瘀血阻滞，或产后百脉空虚，抗病力弱，常伤肾伤血，造成胞宫损伤，由于损伤而自溢，死血瘀滞胞宫，气滞血瘀，以致不能摄精成孕。近年来，随着医学研究的进一步深入，发现肾虚与血瘀二者在病因病机方面互为因果，互为影响，无论是肾阴虚还是肾阳虚均会发生因虚致瘀的病理表现［13］。因此，补肾填精、益气养血活血是改善薄型子宫内膜的关键。宋殿荣等［14］观察补肾活血方对妊娠大鼠子宫内膜容受性的改善情况发现，补肾活血方能明显改善胚泡着床障碍大鼠子宫内膜表面胞饮突的发育，并显著提高子宫内膜整合素αvβ3mRNA的表达，有助于子宫内膜容受性的建立，本研究结论与之相似。从现代药理学角度分析，这可能是由于丹参、当归有增加血管内皮细胞增殖的功效，而菟丝子、桑寄生等可使人着床期子宫内膜组织的血管内皮细胞生长因子及其受体数目均明显增加，进而有利于子宫血管的生成，从而改善子宫血液循环，提高子宫内膜容受性，但其具体的作用机制将在进一步的研究中进行探讨。

综上所述，补肾活血方能够增加子宫内膜各层厚度、腺体数、血管数以及上皮细胞、间质细胞面积。

作者贡献：尹晓丹进行文章的构思与设计，文章的可行性分析，文献/资料收集、整理，撰写论文；何军琴，王景尚进行论文的修订，英文修订；薛晓鸥负责文章的质量控制及审校，对文章整体负责。

本文无利益冲突。

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