缺氧条件下NRF-1基因过表达的大鼠心肌细胞增殖和凋亡变化

孙红丽，杨继辉，牛楠，朱明星，赵巍，宋熔

(1宁夏医科大学，银川750004；2中国人民解放军第五医院)

心脏对氧气的需求较为敏感，缺氧会造成心肌细胞不可逆的损伤，因此，提高缺氧条件下心肌细胞的存活能力显得尤为重要。研究显示，核呼吸因子-1(NRF-1)可以改善细胞在缺氧条件下的存活能力[1]。NRF-1可以通过与过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子1α(PGC1α)结合，调节线粒体的功能，从而增强细胞呼吸能力及代谢水平[2]。因此，了解缺氧条件下NRF-1对心肌细胞的影响具有重要意义。2015年11月～2016年8月，我们构建了NRF-1过表达的大鼠心肌细胞系，观察缺氧条件下细胞增殖及凋亡水平的变化，为心血管系统疾病的研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠心肌细胞H9C2和293T细胞购自中国科学院上海生命科学研究院，感受态细胞JM109购自Promega公司。pCDH-Promoter-MCS-EF1-Puro慢病毒载体购自Invitrogen公司，包装质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)购自SBI公司。TRIzol RNA提取试剂购自Invitrogen公司，限制性核酸内切酶BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ购自Thermo公司，NRF-1兔单克隆抗体购自Abcam公司，鼠抗β-actin单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自中杉金桥公司，AnnexinⅤ-APC/7-ADD凋亡检测试剂盒购自上海钰博生物科技有限公司，PolyJet转染试剂购自SignaGen公司。FACSAriaⅢ流式细胞分选仪购自BD公司，PCR扩增仪购自BIO-RAD公司，CO2培养箱、缺氧用三气培养箱、超高速离心机购自Thermo公司。

1.2 细胞培养与分组处理 向H9C2细胞中加入完全培养液(10%胎牛血清+DMEM高糖培养基+1%双抗)培养。将细胞分为NRF-1过表达组、空载体组和正常对照组。NRF-1过表达组、空载体组分别用NRF-1过表达慢病毒及空载体病毒进行转染，正常对照组不做处理。将三组细胞置于缺氧用三气培养箱中进行缺氧培养(37 ℃、1% O2+5% CO2+94% N2)24 h。

1.3 细胞增殖情况观察 采用实时无标记分析(RTCA)技术。实验前校正E-plate8细胞培养板。取三组细胞，制成细胞密度为1×105/mL的单细胞悬液，取300 μL加入E-plate8细胞培养板中。按照RTCA的操作说明监测缺氧6、12、24 h时的细胞增殖水平。

1.4 细胞凋亡情况观察 采用流式细胞仪。取三组缺氧24 h时的细胞，制成细胞密度为3×105/mL的单细胞悬液，4 ℃离心5 min，弃上清，PBS洗涤，加入5 μL Binding buffer重悬细胞，加入5 μL AnnexinⅤ-APC和5 μL 7-ADD染液混匀，室温避光反应15 min，使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5 细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3) mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。取三组缺氧24 h时的细胞，加入TRIzol液提取RNA，反转录成cDNA，加入caspase-3引物及GAPDH引物进行PCR反应。caspase-3上游引物:5′-TGACTGGAAAGCCGAAACT-3′，下游引物5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCAT-3′。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min，95 ℃ 2 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共30个循环，72 ℃延伸5 min。用2-ΔΔct法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖水平比较 缺氧6 h时，正常对照组、NRF-1过表达组、空载体组细胞增殖水平分别为1.08±0.02、0.96±0.41、0.81±0.02，组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)；缺氧12 h时，正常对照组、NRF-1过表达组、空载体组细胞增殖水平分别为1.07±0.01、1.48±0.12、0.96±0.03，NRF-1过表达组高于正常对照组和空载体组(P均<0.05)；缺氧24 h时，正常对照组、NRF-1过表达组、空载体组细胞增殖水平分别为0.99±0.11、1.00±0.01、0.99±0.01，组间比较差异无统计学意义(P均>0.05)。

2.2 各组细胞凋亡率比较 缺氧24 h时，正常对照组、NRF-1过表达组、空载体组细胞凋亡率分别为39.13%±0.59%、17.17%±0.25%、31.50%±0.90%。与正常对照组和空载体组比较，NRF-1过表达组细胞凋亡率均降低(P均<0.05)。

2.3 各组细胞中caspase-3 mRNA表达比较 缺氧24 h时，正常对照组、NRF-1过表达组、空载体组细胞中caspase-3 mRNA的表达水平分别为0.85±0.14、0.48±0.11、0.63±0.08，NRF-1过表达组低于正常对照组(P<0.05)，NRF-1过表达组与空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

各种应激造成的心肌细胞损伤是心血管系统疾病发生的重要病因，而缺氧造成的心肌细胞凋亡是心肌细胞损伤的重要因素[3]。研究发现，抑制心肌细胞凋亡可有效预防心力衰竭的发生[4]。因此，寻找能够抑制缺氧条件下心肌细胞凋亡的方法对研究心血管疾病具有重要意义。目前基因治疗已被广泛应用于多种疾病的研究中，尤其在心血管疾病的研究中具有很大的发展空间。NRF-1最初是在研究线粒体细胞色素C的表达中发现的一种转录调控因子，其通过参与线粒体的生物合成、信号转导、氧化应激和细胞凋亡等过程来调节细胞的生长代谢[5～7]。研究显示，NRF-1基因敲除鼠在妊娠晚期会造成胚胎致死，表明NRF-1基因在细胞的生长发育中是必不可少的[8]。

NRF-1在一些应激条件下可降低细胞凋亡水平，同时也能提高细胞呼吸能力，增强细胞的存活能力[4]。但在心肌细胞中，尤其在缺氧条件下NRF-1对心肌细胞损伤的影响报道甚少。有研究显示，在缺血性心脏病、心力衰竭、心律失常等疾病中，NRF-1表达水平下降[9]。本研究结果显示，在缺氧条件下，NRF-1过表达组细胞增殖水平较正常对照组和空载体组升高，细胞凋亡水平较正常对照组和空载体组下降，表明NRF-1对缺氧引起的心肌细胞凋亡具有一定的抑制作用。

caspase-3是caspase家族中的成员，正常细胞中caspase-3处于非活化的酶原状态，凋亡程序一旦开始，caspase-3由内源性(线粒体)或外源性(死亡配体)途径活化，随后发生凋亡蛋白酶的层叠级联反应，从而发生不可逆的凋亡[10～12]。有研究报道，心脏在缺血再灌注损伤时caspase-3表达水平升高[13，14]。本研究结果显示，在缺氧条件下，NRF-1过表达组caspase-3 mRNA表达水平降低，表明NRF-1可能与缺氧条件下caspase-3活化的凋亡有关。

综上所述，NRF-1在心肌细胞的增殖过程中发挥重要作用,在缺氧条件下NRF-1基因对H9C2存活能力具有重要影响，其机制可能是通过抑制细胞凋亡实现的。本研究结果表明，NRF-1基因在心血管系统疾病中具有重要的作用，为今后心血管系统疾病的基因治疗提供了一个候选基因。