微针在经皮免疫中的应用进展

张杜娟，李丽萍，张蕊，郭瑞臣

(1济南市妇幼保健院，济南250001；2山东大学齐鲁医院)

疫苗接种是预防传染病的有效手段，可分为病毒疫苗、DNA疫苗和细菌疫苗。随着现代生物技术的发展，疫苗的剂型、接种方式等不断改进，无针接种技术已成为研究热点。经皮免疫(TCI)属于无针接种，系局部应用疫苗抗原和(或)佐剂于皮肤表面，诱导机体产生系统性免疫反应。TCI弥补了传统接种方式的不足，且不经胃肠道降解，作用更持久。微针是TCI中发展较迅速的一种，是由微细加工技术制成的具有不同形状、结构和材料的微米级空心或实心针，刺入皮肤后，在角质层形成多个微米级通道，允许大分子药物或微粒通过。微针细而尖，一般的穿刺深度仅在真皮乳头层，未接触到神经末梢，属无痛给药方式。根据内部结构的不同，微针可分为实心微针、包衣微针、可溶微针和空心微针。目前微针在TCI和疫苗接种领域的研究已取得较大进展。现就微针在TCI中应用的最新研究进展综述如下。

1 微针在病毒疫苗中的应用

病毒疫苗是最常见的疫苗，已有研究使用微针接种麻疹疫苗、脊髓灰质炎疫苗、流感疫苗等病毒疫苗[1～3]。目前，研究广泛的病毒疫苗主要有减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗及病毒样颗粒疫苗。

1.1 减毒病毒疫苗 减毒病毒疫苗是致病性减弱或消失的活病毒株，将其接种到身体内，会引发机体免疫反应，但不会引起疾病的发生。常见的减毒疫苗有麻疹疫苗、带状疱疹疫苗、黄病毒疫苗。但是，减毒疫苗是活病毒株，在实际接种中仍有一定的风险。对于婴儿、孕妇、老人等免疫力低的人群，减毒疫苗可诱发严重疾病；部分减毒疫苗易恢复致病性，如口服脊髓灰质炎疫苗变异后易产生神经毒性，进入中枢神经系统引起瘫痪；另外，减毒疫苗在高于8 ℃环境中不稳定，需低温运输，运输成本较高[4]。

研究表明，微针接种减毒疫苗既可产生较强的免疫反应，又能提高疫苗的稳定性。Dean等[5]使用微针将乙型脑炎病毒减毒疫苗接种于灵长类动物，结果显示，相较皮下注射，微针接种后体内抗体滴度高，病毒血症持续时间长，免疫反应更强。Edens等[6]使用可溶微针为恒河猴接种麻疹减毒疫苗，当接种相同剂量的疫苗时，微针接种和皮下注射可在恒河猴体内诱发相同的抗体水平；但稳定性试验显示，同样在40 ℃条件下保存，液体疫苗7 d失活，冻干疫苗90 d失活，而微针疫苗可保存4个月。同时，有研究发现，疫苗接种时，皮内注射相较皮下注射产生的免疫反应强。Beals等[7]选取224例有水痘史的受试者，将不同剂量的减毒疱疹疫苗经皮下或皮内注射，结果皮内注射剂量为皮下注射的1/3时，却产生比后者更强的免疫反应；当皮内注射剂量为皮下注射的1/10和1/27时，仍能产生与皮下注射相同程度的免疫反应。微针接种属皮内注射，因此可产生较强的免疫反应。

1.2 灭活病毒疫苗 灭活病毒疫苗是指先对病毒进行培养，然后用化学或物理方法将其灭活而制成的疫苗。常见的灭活疫苗有流感疫苗、轮状病毒疫苗、脊髓灰质炎疫苗(注射)、狂犬病疫苗等。灭活疫苗免疫原性低、接种剂量大、因其不会恢复致病性，较减毒疫苗安全。

最新研究显示，使用微针接种灭活病毒疫苗，疫苗稳定性高，机体产生的免疫反应强。Chu等[8]发现，灭活流感病毒疫苗的普通液体制剂在非冷藏条件下1～2周即失活，而可溶微针疫苗在4、25、37、45 ℃条件下均可保存3个月。Kim等[9]研究表明，使用包衣微针接种三价流感疫苗可产生长期交叉保护作用，能预防季节性流感及新的流感病毒株感染。Schipper等[10]发现，用空心微针给大鼠分剂量接种脊髓灰质炎灭活疫苗，可产生较皮下或皮内单剂量接种更强的免疫反应。

1.3 亚单位疫苗 亚单位疫苗是通过化学分解或控制性的蛋白质水解方法，提取病毒的特殊蛋白质结构，筛选出的具有免疫活性的片段而制成的能诱发机体产生抗体的疫苗。与灭活疫苗相似，亚单位疫苗免疫原性低，安全性高，接种剂量大。常见的有流感病毒疫苗、寨卡病毒疫苗等。

微针接种亚单位疫苗也具有产生免疫反应强、疫苗稳定性高等优点。Kim等[11]用可溶微针接种重组寨卡病毒亚单位疫苗，4周后小鼠体内抗体水平保持较高水平，而且免疫小鼠孕育的幼鼠对病毒也有一定免疫性。Koutsonanos等[12]观察了H1N1流感亚单位疫苗经包衣微针接种幼小鼠后引发的免疫反应，结果显示，与肌注相比，微针接种产生的抗体滴度更高；同时，微针接种产生的滤泡B辅助性T细胞水平更高，可调节B细胞分化为记忆B细胞或效应B细胞。Mistilis等[13]发现，热稳定亚单位流感疫苗在含HEPES、醋酸铵缓冲液及精氨酸等基质的制剂中最稳定，此制剂的微针产品可在25 ℃条件下保存6个月。另外，微针接种亚单位疫苗时，免疫佐剂的使用也能提高机体免疫反应。小鼠试验显示，微针接种流感亚单位疫苗时，使用咪喹莫特作为免疫佐剂可提高免疫反应[14]。

1.4 病毒样颗粒疫苗 病毒样颗粒疫苗是含有某种病毒的一个或多个结构蛋白的空心颗粒，没有病毒核酸，不能自主复制，能引起宿主的免疫反应，而不对宿主造成伤害，常见的有流感病毒疫苗。病毒样颗粒疫苗比其他的病毒疫苗稳定，已成为疫苗研究的热点。

病毒样颗粒的微针疫苗具有稳定性高、机体免疫反应强的优点。Quan等[15]通过微针为近交雌性小鼠接种H1N1流感病毒病毒样颗粒疫苗，结果显示，海藻糖能提高病毒疫苗稳定性，机体可获得超过1年的免疫力。另一研究显示，含有流感病毒M2胞外区的病毒样颗粒微针贴片中，疫苗室温条件下可保存8周，同时对H1N1、H3N2和H5N1流感病毒具有交叉保护能力[16]。小鼠试验显示，微针接种此疫苗比肌内注射引起的免疫反应更强。免疫佐剂的使用也能提高机体的免疫性，以鼠伤寒沙门氏菌Ⅰ相鞭毛蛋白为免疫佐剂，微针接种M2病毒颗粒，低剂量接种即可产生比肌内注射高剂量疫苗更好的免疫保护效果，与鼻腔免疫效果相当[17]。微针接种病毒样颗粒疫苗已进入临床试验阶段。美国传染病研究中心(IDRI)用MicronJet600微针为健康受试者皮内接种H5N1病毒样颗粒，该病毒样颗粒以苜蓿植物和吡喃葡萄糖脂质A为原料制成，在300例健康受试者中均未发现严重不良反应[18]。

2 微针在DNA疫苗中的应用

DNA疫苗又称基因疫苗，是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核质粒表达载体直接注射到动物体内，使外源基因在体内表达并产生抗原，激活机体的免疫反应，从而诱导产生特异性的体液免疫和细胞免疫[19]。DNA疫苗可经肌肉或皮肤接种，转染肌细胞或抗原呈递细胞等。与传统疫苗相比，DNA疫苗具有热稳定性好、易于快速大规模生产和安全性高等优势。目前，正在研发的乙肝DNA疫苗HEPLISAV-B正在Ⅲ期临床试验中，与传统乙肝疫苗相比，安全性更高，免疫保护更强。

DNA疫苗的接种方式也是研究热点，研究人员尝试使用不同类型的微针接种DNA疫苗。Hu等[20]用实心微针接种黑色素瘤DNA疫苗，并考察了DNA疫苗的靶向性、小鼠体内抗黑色素瘤治疗和预防免疫效果；结果显示，肿瘤生长受到抑制，B16-移植瘤BALB/c小鼠存活时间延长。Kim等[21]用含pH敏感的聚电解质多层介质的包衣微针接种DNA疫苗，结果显示，与传统的皮下注射相比，微针接种能引起更强的免疫反应。Fernando等[22]研制成一种含有密集纳米阵列的纳米贴片，将流感核蛋白DNA疫苗包衣至纳米贴片上，小鼠使用纳米贴片经皮免疫后，与肌注相比，其体内抗体滴度更高，CD8+T细胞反应更强。Arya等[23]用可溶微针贴从比格犬内耳接种狂犬病DNA疫苗，与同剂量的疫苗肌注相比，产生的抗体滴度相当。Yang等[24]发现，PLGA-聚-L-谷氨酸/聚-γ-谷氨酸纳米粒子与埃博拉病毒疫苗通过静电作用可形成复合物，将复合物装入可溶微针贴片中，接种至小鼠体内，能引发强烈的免疫反应。

微针接种DNA疫苗具有操作简便、无痛、免疫反应强、易于大规模生产等优点。对于像流感、埃博拉和寨卡病毒等引起的感染性疾病，需要疫苗能快速大工业生产，而微针和DNA疫苗的结合是个可能的解决措施。

3 微针在细菌疫苗中的应用

目前正在研制的大多数疫苗针对病毒感染，但也有部分疫苗研究针对细菌感染。大量细菌寄生在人体中，其中多数是非致病菌，也有部分致病菌，能引起炭疽、破伤风、白喉、霍乱、伤寒热和肺结核等疾病。目前，已用于人群的细菌性疫苗有卡介苗、百日咳疫苗、破伤风类毒素疫苗、霍乱弧菌疫苗等。随着微针技术的发展，采用微针接种细菌疫苗的研究越来越多。

在发展中国家，产妇和新生儿破伤风是分娩过程中引起死亡的重要原因，接种破伤风类毒素能有效预防破伤风。Esser等[25]用可溶微针贴片为孕小鼠接种破伤风类毒素疫苗，与肌注相比，产生的免疫反应更强，孕小鼠存活率更高；母体用可溶微针贴片接种疫苗后，12周龄小鼠体内仍可检测到破伤风抗体，当用破伤风毒素感染时，6周龄小鼠存活率100%。可见，用微针接种破伤风类毒素疫苗能有效预防破伤风，操作较简便，具有较好的应用可能性。微针和新剂型的结合也能提高免疫效果。Siddhapura等[26]用实心微针和空心微针为小鼠接种破伤风类毒素壳聚糖纳米粒，与接种传统的破伤风疫苗相比，小鼠体内产生的IgG和IgG1滴度相当，而IgG2a滴度较高，因而产生免疫反应更强。新形式的微针给药系统——点阵辅助粉末经皮给药系统已用于接种卡介苗，体内试验显示，此种接种方式能产生与皮内注射相当的抗体滴度[27]。

微针自90年代出现，就成为经皮给药的研究热点，本文综述了微针在病毒疫苗、DNA疫苗、细菌疫苗接种中的研究进展。使用微针接种疫苗有多种优势：首先，微针接种简单直接，无需专业训练，普通人即可给药；其次，微针细而短，接种疫苗时仅刺穿到真皮乳头层，不触及其中的神经和毛细血管，不带来疼痛；再次，干包衣微针疫苗运输不需要昂贵的冷链系统，降低了运输成本；最后，微针接种节省剂量，微针直接将疫苗接种至富含抗原呈递细胞的表皮层和真皮层，可产生比肌注更强烈的免疫反应。但是，目前尚无上市销售的疫苗微针产品，发展最快的仍处于临床试验阶段。相信随着微针技术的不断发展以及临床研究的不断深入，微针疫苗将逐步进入市场，成为未来TCI的新方式之一。