长爪沙鼠肝脏基因组DNA甲基化水平检测

王志远, 刘月环

(浙江省医学科学院, 杭州 310013)

表观遗传学描述基因如何与周围环境互作, 不改变DNA序列而基因表达发生可遗传的改变，影响机体发育[1]。甲基化是基因组DNA的一种主要表观遗传修饰形式, 是调节基因组功能的重要手段。它是由DNA甲基转移酶催化S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体, 将胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶(5-mC)的反应[2]。对人类及模型动物的研究表明, 高脂饮食诱导或药物作用下，基因组及一些基因均可不同程度地发生甲基化的修饰[3-5]。作者课题组自2005年开始了长爪沙鼠高脂血症的研究，建立了长爪沙鼠非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)模型[6]，该模型与人类疾病特征相似、病变有一定发展过程、形成时间短等优势[7]。长爪沙鼠NAFLD表型的原因并未弄清，因此引入表观遗传标记筛选技术进行该性状的深入研究，为全面地评价模型，或筛选出高效分子标记，具有重要意义。本研究是，尝试将5-mC的免疫学技术用于检测沙鼠的肝脏基因组DNA整体甲基化水平，以评价各组间及各组内部不同个体间甲基化水平的差异，为以后的NAFLD近交系培育打下基础。

1 材料与方法

1.1 动物分组及动物模型的建立

实验用长爪沙鼠由浙江省医学科学院实验动物中心提供并饲养[SCXK(浙)2014-0001]，其中新生雄性仔鼠6只(来自6个家系, 仔鼠组)，3月龄雄沙鼠12只(来自六个家系，体质量50～70 g，每个家系各取1只分别作为青年对照组和青年模型组)，8月龄雄性鼠6只(来自6个家系，中老龄组)，体质量80～100 g。青年模型组鼠经高脂饲料饲喂4周造模。高脂饲料主要成份及配比如下: 商品化基础料80.5%(各成份的配比及生产按照GB14924.3-2010执行)、猪油7%、胆固醇2%、胆盐0.5%、蛋黄粉10%。饲养于本中心[SYXK(浙)2014-0008]。

1.2 肝脏与血液样品的采集

4周造模后，除仔鼠外，各组动物禁食禁饮12 h后，CO2麻醉，腹主动脉取血分离血清用于生化检测, 取肝脏组织，分成2份，1份用于制作病理切片检查脂肪肝形态学，另一份贮存于-80 ℃用于检测肝脏基因组DNA整体甲基化水平。仔鼠组采用剪头取肝脏，方法同成年动物，但由于血量较少，未收集。

1.3 HE染色与血清四项生化指标的检测

取各组长爪沙鼠肝脏大叶相同部位一片，制作切片并做组织形态学观察，总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)等测试试剂盒由上海申能-德赛诊断技术有限公司提供，用意大利产AUTOLAB PM4000型生化分析仪测得。

1.4 甲基化检测

采用Methylamp Global DNA Methylation Quantification Ultra Kit(总体DNA甲基化极易定量检测试剂盒)(比色法)(美国Epigentek公司)，其原理是基因组DNA提取后经过检测纯度、浓度均为合格的样品用移液器加入96孔板后会被固定在这种高亲和性的微孔板上，甲基化的片段会被捕获抗体(Capture Antibody, 即二抗1)以及检测抗体(Detection Antibody, 二抗2，即酶标的能与二抗1结合的抗体)识别，然后使用酶标仪检测 450 nm 处的吸光度(A)值，甲基化DNA的量同测量的A值成正比，利用这种原理对其进行比色法定量。肝脏基因组DNA用DNA提取试剂盒提取，纯度为A260/A280值落在1.8～2.0, 间接ELISA法加样量为100 ng, 操作步骤见试剂盒说明书，过程同普通定量ELISA法试剂盒(将阳性标准品稀释成终浓度分别为0.5 ng/μL、1.0 ng/μL、2.0 ng/μL、5.0 ng/μL 及 10 ng/μL 五管标准样品, 加入相应的孔位，测出A值后用线性回归法做成标准曲线方程，将样品A值代入方程来算出样品中的甲基化水平相对量)，公式如下:5-mC%

其中S为上样量(ng)，P为阳性对照的绝对含量(ng)。由于作标准曲线时阳性对照中只有50%的5-mC，因此乘以2是得到阳性对照中全部5-mC的含量，分母中括号部分是一个阳性样的标准化。实验过程如下: 试剂盒室温平衡→加入做标准曲线的五管标准品、阴性对照及稀释好的各待检样品→混匀后孵育→洗涤→二抗1，孵育→洗涤→二抗2，孵育→显色→终止→读取A值→生成标准曲线→计算各待检样品的相对含量。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 肝组织形态学观察

光学显微镜下可见仔鼠肝脏小叶结构清楚、肝细胞索呈板状排列整齐，肝血窦中存在髓外造血灶的造血细胞的遗存，因此在肝血窦中可见大量成堆分布有单核细胞和成堆的红细胞(图1A), 青年组沙鼠(正常鼠)腹壁无明显的脂肪沉积, 肝脏外观色红、边缘锐利、无明显异常改变，小叶清晰、肝细胞索呈板状排列(图1B)，模型组及老龄组肝脏外观色黄、边缘较钝、触之油腻(图1C、D)，部分还存在脾脏肿大，HE染色结果提示肝脏可见较为明显的的脂肪变性。

2.2 血液生化

与青年对照组、中老龄组相比较,青年模型组造模4周时 TC迅速升高7倍多，HDL、LDL也有显著上升(表1)。中老龄组TG升高较大，与其他组相比有极显著差异(P＜0.01)。因仔鼠血液太少，没有检测。

2.3 肝脏基因组DNA甲基化水平

肝脏基因组DNA整体甲基化检测结果表明, 新生仔鼠肝脏基因组DNA甲基化水平为2.383±0.856,仅次于高脂饲料诱导的青年模型组沙鼠(3.775±1.515)(P＜0.01), 但高于中老龄沙鼠(1.758±1.366)(P＜0.01),相对于青年对照组(0.492±0.332)有极显著差异(P＜0.01)。

3 讨论

图 1 各组动物肝组织的形态学图 (HE×20)Figure 1 Pathology of liver in each group (HE staining×20)

表 1 不同年龄沙鼠4项血液生化指标Table 1 The four serum lipid indexes of different groups mmol/L

本文采用间接ELISA法检测沙鼠肝脏基因DNA甲基化水平。该方法相较于其他检测整体甲基化的方法如荧光定量PCR、高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(HPCE)等，具有简便、迅速、通量高、对仪器要求不严格、易于标准化等特点，在大规模检测筛选中可能具有较强优势。

本研究表明，青年模型组鼠及中老龄组沙鼠均出现高脂血症，肝脏出现较为明显的脂肪变性，而肝脏基因组DNA整体甲基化水平由高到低分别是高脂饲料诱导的青年模型组鼠＞新生仔鼠＞中老龄鼠＞青年对照组鼠。新生仔鼠肝脏基因组DNA整体甲基化水平相对高，这可能与胚胎期的重编程及环境因素有密切关系[8,9]。目前有研究[10]认为NAFLD渐进式发展的病理改变(脂肪肝-纤维化-NASH)是与肝脏基因组甲基化改变密切相关，即体内的甲基供体逐渐减少而致的蛋氨酸循环紊乱有关，也有研究[11]认为体内甲基供体、甲基转移酶以及其他调节甲基化的因素(例如甲基供体与甲基消耗体的动态平衡)共同影响高脂血症与脂肪肝的发生。另外，DNA甲基化的改变不仅具有时间累积效应，而且受饮食习惯、体质量、衰老及环境等的影响[12,13]。由于甲基化在一定范围内是一个动态变化过程[14]，因此，调整外部条件或可致疾病逆转。由此推测，中老龄沙鼠的脂肪肝或许与DNA甲基化的时间累积效应及衰老等因素有关，青年模型组在检测时点上甲基化水平高于对照组，且存在个体间差异，这或许与沙鼠个体内甲基供给与甲基消耗体间平衡有关，去除高脂饮食的脂肪肝症状是可以改善, 因此临床上将脂肪肝视为一种良性的NAFLD。

动物遗传研究表明，CpG岛(基因组中长度为300～3000 bp的富含CpG二核苷酸的一些区域）的甲基化DNA浓度、基因启动子区域甲基化位点数量及频率与动物特定的性状密切相关，是一种潜在的分子标记[15]。由于甲基化(基因表达水平、甲基化位点数量及频率)是可以遗传的，提示其可作为实验动物特定疾病性状的早期选育标记[16,17]。鉴于长爪沙鼠对高脂饲料的易感性及封闭群中存在以年龄段为主的血脂差别性状，结合本次检测结果，显示沙鼠的肝脏基因组DNA整体甲基化水平受高脂饮食及年龄的影响。

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