长爪沙鼠近交系培育中血液生理生化指标的变化

李 迎, 杜小燕, 崔晓霞, 马兰芝, 尚世臣,何晓亚, 黄 斌, 赵 权, 李桂军, 王冬平, 陈振文

(1. 军事科学院军事医学研究院实验动物中心, 北京 100071;2. 首都医科大学实验动物科学部, 北京 100069;3. 吉林农业大学动物科学技术学院, 长春 130118)

长爪沙鼠(Meriones unguiculatus)在解剖学、生理学等方面有许多独特的生物学特征，已被广泛用于医学研究的各个领域[1,2]。近年来,因其脑底动脉环前后交通支存在不同程度的缺失，不能构成完整的Willis动脉环的特性而成为天然的脑缺血动物模型，作为脑缺血或脑梗塞研究的理想模型[3]。本研究是通过亲代脑底动脉Willis环变异缺失表型一致性长爪沙鼠子代进行兄妹交配，定向培育出了脑缺血模型长爪沙鼠近交系，针对该近交系动物培育过程中近交第11至20代(F11到F20)的血液生理生化指标进行动态变化检测，探索变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及饲养环境 普通级脑缺血模型近交系长爪沙鼠120 余只。其中F11～12代 6只(雌4,雄4); F13～14代40只(雌21, 雄19); F15～16代24只(雌12，雄12); F17～18代30只(雌15，雄15);F19～20 代24 只(雌14, 雄10), 年龄为1.5～2.5 年,雌性体质量为68.29～82.09 g, 雄性体质量为65.63～85.40 g, 均为各代繁殖种鼠，均由首都医科大学实验动物中心提供, 动物饲养于普通级环境内, 室温为20～24 ℃, 日常饲喂60Co照射消毒饲料及饮用无菌水，动物自由采食及饮水。本实验通过首都医科大学实验动物和动物实验伦理委员会批准(No.AEEI-2017-032)。

1.1.2 主要试剂仪器 美国Beckman公司提供生化各项指标的配套试剂； 全自动血细胞分析仪的配套试剂为上海东湖生物医学有限公司生产，产品标准编号: YZB/沪 0552-40A-2012。Beckman全自动生化分析仪(CX5)，日本光电全自动血细胞分析仪(MEK-7222K)(动物参数), 低温离心机(CF16RX)。

1.2 方法

1.2.1 血液标本采集和处理 动物空腹12～24 h, 眼眶静脉取血, 静止30 min, 5000 r/min离心10 min制备血清, 质量分数1%的肝素抗凝, 制备抗凝血备用。

1.2.2 测定指标 血液生化指标17项: 总蛋白(TP，g/L)、白蛋白(ALB, g/L)、总胆固醇(CHOL, mmol/L)、甘油三酯(TG, mmol/L)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLD,mmol/L)、尿素氮(BUN, mmol/L)、肌酐(CRE,mg/L)、尿酸(URIC, μmol/L)、总胆红素(TBIL, μmol/L)、丙氨酸氨基转移酶(ALT, IU/L)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST, IU/L)、碱性磷酸酶(ALP, IU/L)、乳酸脱氢酶(LD, IU/L)、肌酸激酶(CK, IU/L)、淀粉酶(AMY,IU/L); 以及镁(Mg, mmol/L)、葡萄糖(GLU, mmol/L)。

血液学指标22项: 白细胞(WBC, 109/L)数、淋巴细胞(LYM, 109/L)数、中性粒细胞(NEUT, 109/L)数、单核细胞(MON, 109/L)数、嗜酸性粒细胞(EOS, 109/L)数、嗜碱性粒细胞(BAS, 109/L)数、淋巴细胞百分比(LYM%)、中性粒细胞百分比(NEUT%)、单核细胞百分比(MON%)、嗜酸性粒细胞百分比(EOS%)、嗜碱性粒细胞百分比(BAS%)、红细胞(RBC, 1012/L)数、平均红细胞血红蛋白含量(MCH, fmol)、红细胞体积分布宽度(RDW %)、血红蛋白(HGB, g/L)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC, g/L)、红细胞压积(HCT, %)、红细胞平均体积(MCV, g/L)、血小板(PLT, 109/L)数、血小板压积(PCT, %)、血小板平均体积(MPV, g/L)、血小板体积分布宽度(PDW, %)。

1.2.3 统计学方法 实验数据采用SPSS 23.0统计软件进行统计分析。多组均数比较先进行方差齐性检验，之后进行单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清生化动态变化

2.1.1 血清蛋白的动态变化 F11～20动物的ALB趋势平稳; TP的曲线在F13～14处于低点, F15～16后平稳(图1)。多重比较F13～14与F15～16和F19～20之间差异极显著(P＜0.01)。

图 1 长爪沙鼠血清蛋白的动态曲线Figure 1 The dynamic curves of serum proteins in gerbil

2.1.2 血清血脂的动态变化 F11～20动物的TG含量从F13～14后趋势平稳; HDLD、CHOL含量F15后呈下降趋势，多重比较HDLD的含量F13～14与F15～20差异显著(P＜0.05); CHOL的含量F13～14与F15～16差异极显著(P＜0.01)。HDLD、CHOL从F15～20后趋势平稳(图2)。

图 2 长爪沙鼠血清脂类的动态曲线Figure 2 The dynamic curves of serum lipids in gerbil

2.1.3 血清代谢产物的动态变化 F11～20长爪沙鼠的BUN、TBIL含量呈下降趋势, URIC含量随代数呈上升趋势，F17后趋于平稳，CRE含量趋势平稳。F11～14与F15～18差异显著(P＜0.05)，BUN含量F17～18与F19～20差异显著(P＜0.05)(图3)。

2.1.4 血清酶的动态变化 ALP、AST含量F11～20代趋势平稳；ALT含量趋势略有上升; LD、CK、AMY含量的趋势呈上升趋势; ALT含量F17～18和F19～20代差异极显著(P＜0.05); LD含量F17～18与F19～20差异极显著(P＜0.01)。方差分析ALT、AMY 差异显著(P＜0.05)(图4)。

2.1.5 血清葡萄糖和镁 F11～20动物的GLU含量呈下降趋势, Mg含量呈上升趋势, MG含量F17～18与F19～20 差异显著(P＜0.05)(图5)。

图 3 长爪沙鼠血清代谢产物的动态曲线Figure 3 The dynamic curves of serum metabolites in gerbil

图 4 长爪沙鼠血清酶的动态曲线Figure 4 The dynamic curves of serum enzymes in gerbil

图 5 长爪沙鼠血清葡萄糖和镁动态曲线Figure 5 The dynamic curves of serum glucose and magnesiumion in gerbil

2.2 血细胞动态变化

2.2.1 白细胞及分类的动态变化 F11～20代动物的LYM指标方差分析差异极显著(P＜0.01)。WBC、EOS、EOS%、NEUT、NEUT%、MON、MON%、BAS、BAS%含量呈上升趋势，白细胞分类含量和百分比的趋势相同, LYM、LYM%呈下降趋势。多重比较: WBC含量F13～14与F17～18差异显著(P＜0.05); LYM、LYM%、MON%、NEUT%、EOS、EOS%、BAS、BAS%指标F13～16与F17～20差异极显著(P＜0.01); 所有指标F17～18与F19～20均差异不显著(表1)。

表 1 不同繁殖代数长爪沙鼠白细胞及分类指标间比较Table 1 Comparison of white cells and classification indices between different reproductive algebras of gerbil

2.2.2 红细胞及相关指标的动态变化 近交系长爪沙鼠培育过程中RBC、HGB、MCH、RDW含量呈上升趋势，HCT、MCV、MCHC呈现趋势平稳。多重比较: HGB、MCH含量F17～18与F19～20差异显著(P＜0.05)(图 6)。

2.2.3 血小板及相关指标动态变化 近交系培育过程中PLT、PCT、PDW含量F呈上升趋势, MPV含量呈平稳趋势(图7)。多重比较: PLT含量F11～16与F17～20差异极显著(P＜0.01)，F17～18与F19～20 差异显著(P＜0.05)(表2)。

图 6 长爪沙鼠红细胞相关指标动态曲线Figure 6 The dynamic curves of red blood cell related indicators in gerbil

图 7 长爪沙鼠血小板相关指标动态曲线Figure 7 The dynamic curves of platelets related indicators in gerbil

表 2 不同繁殖代数长爪沙鼠血小板指标比较Table 2 Comparison of platelet indices between different reproductive algebras of gerbil

3 讨论

血液生理生化指标是实验动物重要的生物学特性指标，其稳定性和一致性是近交系实验动物的主要特征之一。一般而言，当动物按近交系全同胞兄妹配对繁殖20代以后，其各项生物学特性指标会十分接近。近交系的培育过程中，由于基因位点尚未完全纯合，使近交系培育过程中不同代动物的各项生理生化指标不尽一致，但各代之间哪些生理生化指标趋于一致，哪些生理生化指标不易稳定一致尚未见报道。开展此项研究，不但可以从中了解实验动物近交系培育过程中应注意比较哪些生理生化指标的一致性和稳定性，还可一定程度说明随着近交繁殖代数的增加和基因位点的纯合，其生理生化指标也逐渐变化并趋于稳定。

血液生理参数主要是动物自身的遗传因素与环境因素决定。遗传因素是决定实验动物血液生理参数的内在物质基础，而环境因素则是决定血液生理参数变化的外在条件[4]。从实验测定的结果看，脑缺血模型长爪沙鼠近交系培育过程F11～F20的血细胞指标方差分析LYM差异显著，其它指标均差异不显著。WBC、EOS、EOS%、NEUT、NEUT%、MON、MON%、BAS、BAS%、PCT、PLT、HGB呈上升趋势，白细胞分类含量和百分比的趋势相同。HGB、MCH、PLT含量F17～18与F19～20差异显著，其它指标呈现F17～18和F19～20差异不显著。结果表明近交系培育过程遗传因素的变化会对血细胞产生影响，多数指标F17代后平稳趋势体现近交系F20遗传基因的稳定性。

血液生化指标17项实验结果从F11～20动态曲线TP、TBIL、BUN、AMY、CK、ALT含量均趋于平稳，而GLU、URIC、LD含量趋势随着代数上升而上升；MG、HDLD、CHOL含量趋势随着代数上升而下降。F11～20间的TBIL、ALT、AMY差异显著(P＜0.05)。各项指标在F11～20间进行多重比较，血液生化指标ALB、TG、CRE、ALP、AST差异不显著，BUN、ALT、MG含量F17～18和F19～20代差异极显著(P＜0.05); LD含量F17～18与F19～20差异极显著(P＜0.01)，其它指标F17后趋于平稳。结果表明培育代数的差异对大多数生化指标影响较大，指标趋于平稳体现了沙鼠在近交系培育过程中基因的纯合。

血液生化和生理指标在一定程度上能反映动物的新陈代谢和生理机能状况，是判断健康动物状态和选择合格动物的标准,是病理学、毒理学等研究的重要参考数据[5]。并且受诸多因素的影响, 其中以受遗传基因控制为主,同时也受环境、年龄、代数差异及性别等因素的影响[6]。本研究应用的动物虽然是繁殖的种鼠，动物的年龄偏大，对测试血液生理生化有一定的影响，但是每代动物的性能基本一致。此研究描绘的脑缺血模型长爪沙鼠近交系培育过程动态变化，对确定遗传基因对血液生理生化指标的影响，评价近交20代后遗传基因的稳定和生物学特性的一致性也是具有重要的参考价值。

[1] Breuer Z, Mayevsky A. Brain vasculature and mitochondrial responses to ischemia in gerbils.II. Strain differences and statistical evaluation[J]. Brain Res, 1992, 598(1-2):251-256.

[2] Seto-Ohshima A, Katoh M, Yokota S, et al. Two types of aggregate in the cerebral cortex of aseizure-sensitive strain of the Mongolian gerbil[J]. Neurosci Lett, 1999, 277(3):177-180.

[3] 王钜, 卢静, 陈振文, 等. 清洁级长爪沙鼠主要器官重量的测定[J]. 中国比较医学杂志, 2004, 14(4):221-223.

[4] 王钜, 卢静, 陈振文, 等. 长爪沙鼠血液生理生化正常参考值的研究[J]. 中国实验动物学报, 2004, 12(2):108-111.

[5] 孙靖. 实验动物学基础[M]. 北京: 北京科学技术出版社,2005:60.

[6] 何建平, 李金钢, 王智, 等. 棕色田鼠血液生理生化指标的测定[J]. 动物学杂志, 2001, 36(6):50-53.