鸽粪中酵母菌分离与鉴定

马玉英 安尧汶 何严峰

（1，新疆石河子工程技术学校 832000；2，新疆霍城县三宫乡畜牧兽医站 835200；3，新疆塔城市畜牧兽医站 830049）

酵母菌细胞一般成圆形、卵圆形、圆柱形或柠檬形，每种酵母细胞有其一定的形态大小。大多数酵母菌在平板培养基上形成的菌落较大而厚，湿润、较光滑，颜色较单调 （多为乳白色，少有红色，偶有黑色）。红酵母属细胞圆形、卵形或长形，多边芽殖，少数形成假菌丝。无发酵能力，但能同化某些糖类，常污染食品，少数为致病菌。代表种为黏红酵母。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

采自石河子南山石场镇和农八师132团场私人养殖鸽子的新鲜鸽粪，共收集6份样品，石河子南山石场镇和农八师132团各3份，上述样品采集放入无菌三角瓶后，置于4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基

沙堡氏培养基，咖啡酸培养基，尿素酶琼脂斜面，无碳源基础培养基。

1.1.3 主要试剂

0.4﹪的酚红溶液，20﹪尿素溶液，Tween-80溶液，1.6%溴甲酚酒精溶液，山羊血清。

1.1.4 主要仪器

光学显微镜，电子天平，超净工作台，高压蒸汽灭菌锅。

1.2 方法

1.2.1 酵母菌的分离与纯化

（1）将采集的标本每份取1.0g左右放入高压过的小瓶中，加入10ml无菌生理盐水，充分震荡混匀后，静置15min使之，吸取0.5ml上清液接种于沙堡氏培养基 （加有氯霉素）和咖啡酸培养基 （加有氯霉素）置于37℃温箱中培养3d，挑取疑似酵母菌的菌落，革兰氏染色后镜检，确认为真菌后接种到沙堡氏培养基 （加有氯霉素），纯化2～3次接种到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培养3d，置于4℃冰箱中保存备用。

（2）将采集的标本每份取1.0g左右放入高压过的三角瓶中，加入20ml普通肉汤 （加有氯霉素）后置于37℃温箱中培养3d，革蓝氏染色后做显微镜检查，确认为真菌后接种到沙堡氏培养基 （加有氯霉素），纯化2～3次接种到沙堡氏斜面 （加有氯霉素）培养3d，置于4℃冰箱中保存备用。

1.2.2 酵母菌的鉴定

1.2.2.1 酵母菌形态学的鉴定

（1）菌落特征的观察

将被检菌在沙堡氏培养基 （加有氯霉素）上37℃培养1～3d，选择单个典型菌落起颜色、形状、透明度、光滑度、湿润度和边缘整齐情况等特征。

（2）细胞形态的观察

将被检菌在沙堡氏培养基 （加有氯霉素）上37℃培养1～3d，逐日选择单个典型菌落进行革兰氏染色后显微镜检查，连续7d。

（3）微培养的观察

有小培养法将被检菌接种到玻片上，逐日在显微镜下观察被检菌的生长、菌丝、孢子情况。

1.2.2.2 酵母菌特性培养的鉴定

（1）最适生长温度的试验

将接种好的沙堡氏斜面 （加有氯霉素）分别放入不同温度的条件下培养，观察其生长过程有何不同。

（2）尿素酶试验

将被检菌生长旺盛时接种到尿素酶斜面上，放入37℃温箱中培养1～7d，逐日观察尿素酶斜面有无颜色变化，若斜面由淡红色变为紫红色为阳性，不变色则为阴性。

（3）咖啡酸试验

将被检菌生长旺盛时接种到咖啡酸培养基上，放入37℃温箱中培养1～7d，逐日观察咖啡酸培养基有无颜色变化，若培养基变为棕褐色为阳性，不变色则为阴性。

1.2.2.3 酵母菌的生化鉴定

（1）发酵试验

将被检菌生长旺盛的时候分别接种到蔗糖、麦芽糖、乳糖与葡萄糖培养基中，放入37℃温箱中培养1～7d，逐日观察糖培养基有无颜色变化和气泡产生，培养基不变色，不产生气泡为阴性，有颜色变化，产生气泡或两种情况同时存在则为阳性。

（2）同化试验

先制作无碳源基础培养基，将被检菌混入无碳源基础培养基中倾倒平板。凝固后贴附含糖 （15﹪的糖水）滤纸片。阳性在纸片周围有一圈明显的生长圈，无生长圈则为阴性。

1.2.3 动物试验

将培养好被检菌悬液 （9亿菌），用无菌针管各吸取1ml分别注入6只健康的小白鼠腹腔内并做一阴性对照，在随后的一个月内观察小白鼠变化。

2 结果与分析

2.1 鸽粪中酵母菌的分离

通过培养、纯化与镜检，6份样品均分离出疑似酵母菌。

2.2 菌落形态和细胞形态

从6份鸽粪样品中分离的酵母菌，观察菌落形态 (酵母型菌落)、细胞形态及小培养观察结果见表1、表2。

2.3 特性培养鉴定与生化鉴定

通过试验发现，被检菌在25～28℃为最适生长温度，在该温度范围内，被检菌生长最快。其他培养特性鉴定和生化鉴定结果见表3。因6份样品中分离出来的疑似酵母菌在培养特性鉴定与生化鉴定结果相同，故不作单个介绍。

2.4 动物试验

从小白鼠人工感染被检菌以后，通过近两个月的连续观察，除一只小白鼠意外死亡外，其余6只小白鼠一直保持健康状态，无任何疾病症状，从而说明该酵母菌无致病性。

3 讨论

3.1 酵母菌的分离纯化

菌种分离提纯应尽可能做到全面、细致、不丢、不重，在试验过程中对样品进行2～3次分离。分离培养的温度为37℃，虽然适合大多数酵母菌生长，但通过这次试验获知大多数酵母菌的最适生长温度在25～30℃左右，沙堡氏培养基上生长良好。

3.2 酵母菌属的鉴定

表1 菌落形态

表2 细胞形态和小培养鉴定结果

表3 培养特性鉴定与生化鉴定结果

根据 《酵母菌特性及鉴定手册》和 《医学微生物学实验技术》等介绍的方法，酵母菌的鉴定主要以形态学特征为主并结合生理学特征。形态学特征包括菌落形态、细胞形态、假菌丝、子囊孢子等，生理学特征包括芽管试验、葡萄糖发酵、同化试验等。从实验结果可以看出，酸鸽粪中的酵母菌形态相似，种类不多，从6份样品中分离得到酵母菌经属的鉴定为同一属酵母菌：红色酵母属。