自噬及其调控机制的研究进展*

林怡婷 丁羚昱 初 明 王月丹

（北京大学基础医学院免疫学系 北京 100191）

“自噬”可能是2016年生物医学领域最为令人关注的热词之一，因为日本科学家大隅良典凭借发现自噬过程及其调控的具体机制而获得了这一年的诺贝尔生理学或医学奖。

1 自噬现象的发现及其研究概况

1963年，比利时生物化学与细胞生物学家de Duve发现细胞的溶酶体中存在着大量的细胞内源性物质，甚至还可以从中找到完整的细胞器。根据这个现象，de Duve推测细胞可能会通过某种机制，将大量的细胞内源性物质传输到溶酶体中。进一步的生物化学和显微形态学的分析研究表明，在细胞中存在着一种囊泡，专门负责将细胞内容物运输进入溶酶体中进行降解。为此，de Duve首先创造性地将这种现象命名为“auotophagy”（自噬），并将在自噬过程中具有运输功能的囊泡命名为自噬体。“Autophagy”一词来源于古希腊语，就是“自己把自己吃掉”（self-eating）的意 思［1］。 虽然 ，de Duve因为发现过氧化体和溶酶体等细胞结构，而在1974年与阿尔伯特·克劳德及乔治·帕拉德一起获得了诺贝尔生理学或医学奖，但是，长期以来有关自噬的生理意义及其确切的调控机制一直都是细胞生物学研究的热点，相关的研究成果不断涌现。

在自噬诱发与调控的研究方面，1967年，de Duve和Deter在大鼠正常肝脏细胞中观察到饥饿状态可以促进细胞自噬活动的现象，从而证实了胰高血糖素可以诱导细胞自噬的发生［2］。之后，人们发现胰岛素［3］及一些代谢或降解产物（例如氨基酸［4］和 3-甲基腺嘌呤［5］等小分子）均可以抑制肝细胞的自噬，而一些细胞内的蛋白激酶和磷酸酶参与自噬的调节过程［6］，因此证实自噬是一种适应性的代谢与能量再生过程。

在自噬的生理学功能方面，也取得了很多的研究成果。de Duve首先发现多数具有生命活动的细胞都可以通过一种非特异性的分离机制，在溶酶体中消化其自身的细胞质成分，特别是对细胞器这一类的大体积物质，这是细胞清除细胞内异常蛋白或细胞器的一种选择性的蛋白降解机制［1］。此后，通过基于细胞形态学分析的研究，滑面型内质网［7］、线粒体［8］和过氧化物酶体［9］等多种细胞器经过自噬被吞噬消化清除的现象，均被发现。而Seglen等则利用放射性探针细胞内注射的技术，在自噬早期和中期，发现并定义了吞噬泡及自噬内涵体等自噬的过程产物［10］。这些研究还进一步证实，在酵母及高等生物的真核细胞中，自噬过程是有选择性的，可以被线粒体膜电位变化等因素而诱导发生［11］，参与昆虫变态等重要的生理过程［8］，是生物生长发育所必需的一个关键生命活动环节。

1988年，日本科学家 Yoshinori Ohsumi（大隅良典）开始以酵母细胞作为研究自噬现象的细胞模型，聚焦细胞囊泡蛋白与自噬机制的研究。但在研究中，他发现酵母细胞体积极小，不易于观察其中囊泡的运输和变化过程。为解决此问题，Ohsumi设计、构建并培养了具有囊泡降解蛋白缺陷的突变型酵母细胞。1997年，通过诱发这些酵母细胞发生自噬现象和上调囊泡蛋白表达的研究，Ohsumi发现了一系列在自噬过程中具有关键作用的基因——自噬相关基因（autophagy－related gene，Atg）。后来，他还在人类细胞的研究中，证实了ATG在自噬过程也具有十分关键的作用［12］，阐明了自噬在各种生理及病理过程中的作用及其机制，为深入研究自噬的具体机制打下了坚实的基础，并因此获得了2016年诺贝尔生理学及医学奖。

2 自噬的概念及其分型

自噬现象是从酵母到哺乳动物等真核细胞在进行细胞内物质代谢时，都具有的一种高度保守性的溶酶体降解途径。目前，一般普遍认为，自噬是指真核细胞将其细胞内的大分子物质和细胞器等成分，通过一定的机制运输到溶酶体中，进行隔离和降解的过程。在正常的生理状态下，细胞通过自噬的过程及时清除细胞内发生损伤或衰老失能的细胞器，以及长半衰期的蛋白质、在合成或折叠过程中发生错误的蛋白质分子等可能影响细胞稳态和生理功能的物质，从而保持细胞自身结构的稳定和功能的平衡［13］。

现在的研究结果表明，细胞的自噬可以根据发生的机制和负责运输的细胞内容物不同，而分为巨自噬（macroautophagy）、微自噬（microautophagy）及分子伴侣介导的自噬（chaperon mediated autophagy）3种不同的类型。其中，分子伴侣介导的自噬是指在具有选择性递送功能的LAMP2A等分子伴侣的协助下，底物直接进入到溶酶体中被降解的过程。微自噬则是指溶酶体膜通过自身的变形，直接将胞浆中的底物摄取到溶酶体中进行降解的过程，细胞质成分直接被溶酶体内陷所吞噬。巨自噬是细胞内最常见的一种自噬形式，其发生的过程可以分为4个阶段：①分隔膜的形成，②自噬小体的形成，③自噬体的运输、融合，④自噬体的降解［14］。其中，只有在巨自噬的过程中，才会有双层膜结构的自噬体形成，从而选择性或非选择性地将细胞质成分包裹起来并运输到晚期内体与溶酶体融合，降解并回收再利用其中的营养物质。同时，巨自噬也是细胞内最普遍和最具有代表性的细胞物质自我降解途径，通常也被简称为“自噬”，作为自噬现象的代表。所以，一般情况下，在不明确说明时，文献中提到的“自噬”是指巨自噬。

3 自噬的过程及其调控

自噬的基本过程与自噬的类型有关，分子伴侣介导的自噬和微自噬的过程相对简单，在此不再赘述。以下主要以巨自噬作为代表，阐述自噬的过程与调控。

哺乳动物细胞的自噬往往是由吞噬泡的形成开始的，然后其中的分隔膜通过延伸和闭合，从而包裹一部分细胞质形成双膜的自噬体。当自噬体与内体或溶酶体对接和融合，形成自噬内涵体或自溶酶体时，即达到自噬体的成熟。此时，自溶酶体内的酸性水解酶能破坏和降解自噬体内膜及其内容物，其产物则会被细胞再次循环利用。

自噬的功能对细胞来说，具有双重性：一方面，自噬可以帮助细胞回收生物大分子，应对如营养匮乏、生长因子耗竭、低氧或缺氧等细胞代谢应激；还能帮助细胞清除错误折叠的蛋白质或有缺陷细胞器，防止异常蛋白的积聚并清除胞内的病原体，发挥监控和防御作用。另一方面，自噬的过度活跃则可能会导致细胞的自噬应激，对细胞器造成损伤，促进自噬性细胞死亡（也被称为Ⅱ型程序型细胞死亡），或通过激活凋亡/坏死通路使细胞死亡。

现在已知的很大部分与自噬相关的基因来自于大隅良典对酵母细胞的研究，这些基因被命名为自噬相关基因（Autophagy-related gene，ATG）［15］。在酵母细胞中，与自噬相关的蛋白质组成了以下几种复合物：由 ATG1、ATG13、ATG17、ATG29、ATG31等组成的ATG1蛋白复合物；由ATG2和ATG18组成的蛋白复合物，其具有能够结合PI（3）P的功能；由ATG12、ATG5、ATG16等组成的蛋白复合物；由 ATG6、ATG14、Vps15、Vps34 等组成的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）蛋白复合物。除此之外，能够被磷脂酰激醇修饰的ATG8及ATG9在自噬过程中也发挥了重要的作用［16］。在哺乳动物中起作用的自噬核心复合物有以下几种，与酵母细胞有一定类似性：ULK复合物——在自噬起始过程中起作用；PI3K复合物——在自噬小体形成过程中发挥作用；ATG12-ATG5复合物和ATG3-ATG8复合物——2个类似于泛素化连接的复合物。

ULK1/2是自噬发生过程中处于最上游的调控基因，主要定位于细胞浆，哺乳动物中的ULK复合物包含 ULK1/2、Atg13、Atg101和 FIP200几个部分等［17］。在自噬发生的初期，ULK复合物开始组装并与自噬双层膜结合，这对自噬小体的形成至关重要。在之后的自噬双层膜延伸过程中，Atg12-Atg5-Atg16组成的类似于泛素连接的蛋白复合物发挥了十分重要的作用。首先，Atg12在Atg7的作用下与Atg7形成共价连接。之后，Atg12在Atg10的帮助下，将Atg7取代，形成Atg12-Atg10共价结合蛋白。最后，在Atg5作用下，Atg12和Atg5形成Atg12-Atg5共价结合蛋白。由于Atg16本身是二聚体，该蛋白通过与Atg5结合形成同源的Atg12-Atg5复合物二聚体，并在自噬双层形成过程中对双层膜的延伸弯曲起至关重要的作用。Atg8在哺乳动物中的同源蛋白是LC3，LC3是检测自噬变化的标志性蛋白，这是由于它在自噬小体双层膜延伸至自噬小体膜结构闭合的过程中起着关键的作用［18］。在自噬小体形成的过程中，LC3在Atg4B的作用下，第120位的甘氨酸发生分解使LC3被截短并与Atg7形成共价复合体。随后，Atg3替换掉Atg7，并在Atg12-Atg5-Atg16复合物的协助下与磷脂酰激醇（PE）连接，从而形成LC3-PE复合体。LC3-PE定位于自噬小体双层膜的两侧，参与自噬小体双层膜的延伸。除此之外，LC3-PE还能与一些自噬底物的连接分子结合，将底物包裹至自噬小体内，发挥识别的作用。高等动物细胞内主要有 4类PI3K复合物［19］，其中主要在自噬过程中发挥作用的是第3类PI3K复合物，由催化亚基Vps34和调节亚基Vps15组成，能催化磷脂酰肌醇生成 PI（3）P［20］。 Beclin 1蛋白与Vps34结合的翻译后修饰能够调节Vps34的活性。在细胞处于营养充足的条件下，定位于内质网上的Bcl-2能与Beclin 1结合并抑制Vps34的活性［21］。Vps34的活性可以受到许多调节蛋白作用的调控，从而影响自噬过程的发生。

总之，自噬过程的调节非常复杂和精细，至今仍然是广受研究者关注和不断进行探索的热点领域之一，有很多的确切机制，还有待更多的研究进行阐明和揭示。

4 自噬在细胞生理及病理状态下的作用及其意义

自噬通过消除受损和衰老的细胞器及长寿命蛋白、合成错误或折叠错误的蛋白质等，维持细胞自稳状态。这个过程不仅为细胞提供营养，也为细胞提供必不可少的保护和监管［13］。

当细胞处于营养匮乏、缺氧、病原体感染、内质网应激、严重组织损伤等情况下，自噬通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian rapamycin，mTOR）依赖性通路和mTOR非依赖性通路被激活。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB）信号通路的效应器，mTOR能整合代谢信号，包括氨基酸和生长因子及氧和能量水平，以协调细胞生长、增殖和代谢过程以维持细胞内稳态。通常情况下，mTOR具有抑制自噬的作用。在细胞处于低能量水平时，5′-AMP活化蛋白激酶 （AMPK）激活，抑制mTORC1活性，通过mTOR依赖的途径调节自噬的发生，并通过ULK1的磷酸化直接调节自噬，实现对自噬作用的双重活化。在缺氧情况下，HIF1α转录因子可激活BNIP3和BNIP3L等多种缺氧反应基因的表达，这些基因也可以增加线粒体自噬的发生。而BNIP3也能通过抑制mTORC的活性结合，进一步促进自噬的发生［22］。

此外，当细胞处于饥饿状态下，c-Jun N末端蛋白激酶1（JNK1）可通过磷酸化Bcl-2并以此破坏其与BECN1的相互作用［23］，而诱导自噬的发生。氧化应激时，死亡相关蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶（DAPK）活化，可以磷酸化 VPS34导致自噬体形成，以VPS34依赖的方式促进自噬的发生。

自噬具有维持细胞稳态的功能，也能作为不同压力下的保护机制，维持细胞的生理功能，它是细胞适应在各种环境下生存的必要条件。因此，在感染、神经退行性疾病、心血管和免疫疾病、糖尿病和恶性肿瘤等疾病状态下，自噬都是一种常见的细胞生物学现象，在这些疾病的发生发展中，扮演着十分重要的角色。以下以自噬与肿瘤发生发展的关系为例，简要阐述自噬在这些疾病病理生理变化过程中的作用和意义。

自噬在肿瘤发生发展的不同阶段发挥着不同的作用。在肿瘤的发生阶段，自噬主要发挥抑制肿瘤发生的作用，主要体现在以下4个方面：①通过线粒体自噬等方式，降解并清除功能紊乱的细胞器。现在的研究证据表明，自噬是唯一一种能在细胞内运送、在溶酶体内降解及清除线粒体这样大而完整细胞器的机制。当细胞线粒体发生异常时，膜通透性增加，会产生大量的活性氧（ROS），从而激活自噬并清除受损的线粒体，达到抑制肿瘤细胞发生的作用。②通过自噬途径，诱导非凋亡性细胞死亡。例如，干扰自噬基因ATG5的表达，能有效地阻止依托泊苷（etoposide）诱导的 bax-/-和bak-/-小鼠胚胎纤维母细胞（MEFs）的死亡。某些肿瘤细胞由于在凋亡通路上存在着一些特异基因的突变，不能通过凋亡形式引发程序性细胞死亡，但人们仍然可通过诱导其自噬途径的活化而将其清除。③自噬通过抑制炎症反应，阻止肿瘤的发生。坏死细胞能释放出的核苷酸和组蛋白等内介素的成分，这些危险相关分子模式（DAMPs）信号通过激活Toll样受体促进炎症的发生，并在组织损伤修复和炎症发生及持续过程中发挥信号转导的作用。这些炎症信号如果长期存在，将会导致局部免疫微环境的紊乱。因此，如果组织损伤不能在一定时间内得到修复，肿瘤就有趁虚而入的可能。④细胞通过自噬，维持染色体的稳定性。研究结果表明，Beclin1等位基因的缺失与染色体的增加或缺失有关。自噬能通过避免或减少染色体不稳定性的发生而减少或者避免肿瘤细胞的产生。

但是，在一些肿瘤进展的阶段，自噬又可能发挥一定的促进作用，主要包括如下机制：①自噬为肿瘤细胞提供保护，并促进其存活。例如，在一些Ras基因被激活的肿瘤中，例如胰腺癌，肿瘤细胞依赖于自噬上调的方式存活生长。而缺氧环境中，非折叠蛋白反应（UPR）能诱导自噬基因MAP1LC3B和ATG的活化，导致自噬，并保护肿瘤细胞在缺氧微环境中的生存［27］。②自噬抑制肿瘤细胞的凋亡，维持其生存。例如，自噬能通过上调高级糖化产物受体（AGER）的产生，而减少胰腺癌细胞的凋亡。③自噬增强肿瘤细胞对放疗、化疗或其他疗法的抵抗力和耐受性。化疗或放疗可以导致肿瘤细胞内产生大量受损细胞器及异常蛋白质等有害成分，从而杀伤肿瘤细胞。但是，此时肿瘤细胞可通过提升自噬的活性而及时清除这些对肿瘤细胞有害的细胞内物质，并用于提供细胞应急状态下所必需的营养物和能量，修复受损的细胞结构与功能，进而保护肿瘤细胞免于发生凋亡性细胞死亡，以维持肿瘤细胞的持续增殖。例如，在抗癌药硼替佐米（Bortezomib）诱导的乳腺癌细胞株MCF-7细胞死亡时，细胞自噬活性的增加使MCF-7细胞对Bortezomib产生更高的耐药性。

5 自噬研究的未来与展望

随着大隅良典获得诺贝尔奖，自噬现象及其机制的研究，再次受到人们的广泛关注，仅在我国2016年批准立项的与自噬相关的科研项目就多达72项，资助总金额高达上千万元。相信这些研究有助于进一步揭示自噬的发生机制及其在细胞生命活动中的作用，为延长人类寿命和促进生命健康，发挥积极的促进作用。