2种注射液的无菌检查法的建立与验证

方剑儒 张连钢 薛晓莉

（1张掖市食品药品检验检测中心 甘肃 张掖 734000）（2嘉峪关市食品药品和医疗器械检验检测中心 甘肃 嘉峪关 730020）

注射液的无菌检查是保证药品使用安全的一个重要方面，选择合适的试验方法，才能保证药品的质量要求。呋塞米注射液为利尿剂，异烟肼注射液是抗结核药，同作为本单位第二季度的基本药物品种，由于生产企业未提供无菌检验适用性试验的方法，为保证无菌检验结果的准确可靠，确认采用的方法适合于各供试品的无菌检查[2]，笔者对2种注射液的无菌检查法分别进行了方法适用性验证，以保证所采用的方法适合于该2种注射液的无菌检查。

1.仪器与试药

1.1 试验仪器

GJ-204A型洁净工作台（江苏无锡市威达净化空调电气设备厂）、一次性全封闭集菌培养器、Htysteritest601型智能集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）、SPX-250型生化培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）、SPX-150型生化培养箱（惠科电子有限公司）。

表 试验组与阳性试验组观察结果

1.2 试验样品

呋塞米注射液（遂成药业股份有限公司：批号：1702172；上海禾丰制药有限公司：批号：34161102）；异烟肼注射液（西南药业股份有限公司：批号：170411，170413）。

1.3 试验试剂

胰酪大豆胨液体培养基（批号 20150914）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号 20150722）、硫乙醇酸盐硫体培养基（批号20150104）、pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液（批号 20160715），以上培养基均由青岛高科园海博生物制品购买。

1.4 试验菌株

黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)[CMCC(B)26003]、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[CMCC(B)10104]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、白念珠菌(Candida—albicans)[CMCC(F)98001]、黑曲霉(Aspergillusniger) [CMCC(F)98003]，均为第2代菌株，以上菌株均由中检院购买。

2.方法与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪胨大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24h，接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养24～48h，接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养液上，20～25℃培养5～6d，经含0.05%聚山梨酯80的无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液5mL清洗孢子，将孢子悬液吸出转移至无菌试管内，用含0.05%聚山梨酯80的pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液稀释成每毫升含孢子数小于100cfu的孢子悬液。上述菌悬液经培养计数，菌落数均在10～100cfu/ml之间。

2.2 方法学验证试验

2.2.1 试验组 先用少量无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜，取规定量的供试品，按薄膜过滤法过滤，采用不冲洗、每膜100mL、每膜200mL的无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗后，在最后一次的冲洗液中加入1ml（小于100cfu/ml）的试验菌，过滤，分别加硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml至滤筒内，按规定条件进行培养，逐日观察。结果见表1。

2.2.2 阳性对照组 另取滤膜，先用少量无菌pH7.0氯化钠一蛋白胨缓冲液润湿滤膜，分别加硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml和1ml（小于100cfu/ml）的6种试验菌至滤筒内，作为阳性对照，按规定条件进行培养，逐日观察。结果见表。

2.2.3 阴性对照组 先用少量无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液润湿滤膜，不加供试液，不加试验菌，取与供试品等量的无菌pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，分别置2个滤筒内过滤，分别加硫乙醇酸盐流体培养基100ml和胰酪大豆胨液体培养基100ml至滤筒内，作为稀释剂和溶剂的对照，按规定条件进行培养，逐日观察。结果见表。

2.3 结果

从表1试验结果表明，呋塞米注射液和异烟肼注射液均存在抑菌性，不能直接进行薄膜过滤法检查，需要采用稀释剂冲洗的方法，pH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗1次（100ml/膜）就可以消除这两种注射液的抑菌性。

根据以上验证试验方法，按照2015年版四部药典“1101 无菌检查法”依法进行操作，分别对2种注射液4批样品进行了无菌检查的方法验证，结果表明4批样品的阳性对照在规定时间和条件下均生长良好，阴性试验组与供试品均澄清无浑浊，结果符合规定。

3.讨论

为了选择合适的试验方法，本实验对2种注射液按薄膜过滤法，进行不冲洗、每膜100mL、每膜200 mL进行冲洗的方法，结果表明不冲洗的2种注射液均存在轻微的抑菌性，需要进行稀释剂冲洗来消除其抑菌性，结果，2种注射液每膜100ml、200ml冲洗管在规定条件和时间内菌落生长良好，表明这2种注射液可以采用以每膜100ml冲洗液进行冲洗，以消除其抑菌性。

先确定了供试品的抑菌性及消除方法后，分别对每种注射液用6种对照菌进行检查，从而确定每一种注射液的敏感菌株，结果6种对照菌实验组的与对照组生长情况基本一致，无明显差异。按参考文献[3]规定，无抑菌作用及抗革兰阳性菌为主的供试品，以金黄色葡萄球菌为对照菌。

为考察试验方法的适用性，保证试验的准确无误，分别对本单位第二季度的基本药物呋塞米注射液和异烟肼注射液进行了无菌检查的验证试验，结果均符合规定，表明试验的方法是可行的，可以用于上述2种注射液的无菌检查。

【参考文献】

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部[S].北京：中国医药科技出版社,2015：362-382.

[2]中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[M].中国医药科技出版社，2010：313-323.

[3]方玲芬.盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查法方法学研究[J].中国药事，2006，20(9)：554356.

[4]渝琼，嵇扬，高锦，等.复方茵陈注射液无菌检查方法验证实验[J].解放军药学学报，2008，24(5)：468-469.

[5]渝琼，嵇扬，高锦，等.维生素取氯化钠注射液无菌检查方法验证实验[J].解放军药学学报，2008，24(6)：563-564.