阿拉伯半乳糖蛋白在植物根发育过程中的研究进展

曾伟， 江艾西， 涂金华， 汤行春

(湖北大学 生命科学学院， 湖北 430062)

阿拉伯半乳糖蛋白(AGPs)为一类分布于植物细胞中富含羟脯氨酸且高度糖基化的糖蛋白家族[1-2]。人们采用生理生化、免疫组化以及分子生物学等技术对AGPs的生物学功能进行了较为深入的研究，结果表明，AGPs参与了植物细胞增殖与膨胀、细胞分化、有性生殖中配子发育、胚胎模式建成等[2-5]。高等植物的有性生殖涉及雌雄配子体发育、雌雄配子的识别以及胚胎发生等过程，它在植物生活史占有重要地位，已有研究和综述对这方面的工作进行了阐述[ 6-8]。因此，本文仅就AGPs在植物根发育过程中的作用以及根与微生物相互作用进行评述。

1 AGPs的分子结构与作用模式

1.1 AGPs的分子结构与类型

AGPs由核心蛋白骨架及糖基侧链组成，核心蛋白骨架富含羟脯氨酸、丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸，而糖基侧链主要包括半乳糖和阿拉伯糖。由于不同AGPs的核心蛋白骨架、糖基侧链组成成分以及糖基化修饰位点均具有较大差异，因此, AGPs是高度异质性的糖蛋白[9]。目前，AGPs可分为经典AGPs(classical AGPs)、非经典AGPs(non-classical AGPs)、AG(acid glycoprotein)肽和类成束蛋白AGPs(fasciclin-like AGPs，FLAs)[1]。

经典 AGPs由N-端信号序列、富含 Hyp/Pro、Ala、Ser/Thr 的中间可变区以及C-端疏水区3个部分组成。C-端疏水区被认为是GPI锚(glycosylphosphatidylinositol，GPI-anchor),40%的GPI 锚含有 AG 糖基元件[11-12]。GPI锚的合成比较复杂，是经典AGPs与非经典AGPs最重要的区别，在内质网膜的外侧，由不同PIG(phosphatidylinositol glycan)与GPI1组成的复合酶将N-乙酰葡糖胺转移到磷脂酰肌醇上，经PIG-L酶处理后成为Gn-PI，再经构象变化并由内质网膜的外侧转运至膜内侧，随后在酶的作用下将3个甘露醇连接到PIG上，并通过GPI8，GAA1将合成的蛋白骨架在C-末端的相应位点切割下来，GPI锚通过转酰胺基作用加到此处，而后将未成熟的AGPs转移到高尔基体上并添加糖基侧链，通过小泡运输到细胞膜上[13]。

非经典AGPs不仅具有Hyp/Pro富集区域，而且富含天冬酰胺(Asn)或半胱氨酸(Cys) 区域[9,13]。与经典AGPs不同的是，非经典的 AGPs 不具有 GPI 锚，其核心蛋白骨架比经典AGPs的异质性更高[12-13]。AG肽为仅具有10～15氨基酸的成熟蛋白骨架。类成束蛋白AGPs常被称为嵌合的AGPs，不仅包含一个AGP的基本框架，还含有1～2个具有黏附作用的成束蛋白结构域[13-14]。

1.2 AGPs的作用模式

AGPs的结构中包含有不同类型的糖链，有些AGPs还具有GPI锚的特征。根据不同类型的AGPs结构特征，人们推测AGPs的作用模式，一种作用模式认为，AGPs侧链的糖基可以被专一酶类水解后释放到胞外基质中，这些糖基分子可以充当信号分子或营养[2,9]；另一种作用模式认为，经典AGPs的GPI锚被切割后，整个AGP蛋白释放，其本身就可能参与信号转导[13]。最近，有研究表明，AGPs可以作为Ca2+的螯合剂，在一些特殊条件下，AGPs可以使细胞控制Ca2+的释放[15]。另外，Olmos等[16]提出一种新的作用模式，他们认为，在盐胁迫下，AGPs可能作为钠离子载体经膜泡运输，将钠离子从质外体转运到液泡，使细胞适应盐胁迫环境。尽管如此，人们所提出的这些作用并不互相排斥，相反，这些大分子的复杂特点可能导致它们采取不同的方式调控植物的生长发育。随着分子生物学的兴起，人们对一些AGPs的基因序列和表达模式有了一定了解，结合免疫组化技术和细胞培养技术，分子生物学技术和手段为AGPs的功能研究提供了新的方法。

2 AGPs与根的发育

最初，人们利用AGPs的特异性抗体来揭示其在植物组织中的定位，单克隆抗体大多数是针对AGPs的侧链糖基，比较常用的AGPs抗体有JIM系、MAC系以及LM系[9]。不同单克隆抗体识别的AGPs在植物根组织发育中有其特定的分布，JIM4识别的AGPs与胡萝卜根早期维管组织的发育相关，可以作为中柱鞘细胞发育的分子标记，JIM14识别AGPs与根细胞中次生加厚的筛管有关[17]，而JIM13识别的AGPs定位在幼嫩的木质部以及根冠和边缘细胞中[18]；在单子叶禾本科植物大麦的根毛发育中，LM2、LM14识别的AGPs定位于野生型的根毛生发细胞的细胞壁和细胞质中，而无根毛的突变体仅出现在所有表皮细胞的细胞质中[19]，这些结果暗示不同抗体识别的AGPs参与根的次生组织细胞壁加厚以及形成层细胞分化的调控。结合生物信息学和分子生物学技术，基于AGPs相关基因的表达模式也进一步证实了多种类型的AGPs基因在根的不同组织部位特异性表达，其中包括一些非典型AGPs，如AtAGP30定位在根的伸长区，AtAGP31、AtFLA1定位在根的韧皮部和初生木质部[20-23]，且这些AGPs在根中的分布随发育进程而改变，推测AGPs在根的形态建成中起非常重要的作用。

AtAGP30为第一个发现在拟南芥根中特异表达且富含组氨酸的AGPs基因，在根分生组织和伸长区的非根毛表皮细胞中表达，参与了这些细胞的形态维持、根的再生[20]。用AGPs专一结合的β-GlcY试剂[(β-glucosyl)3]Yariv等[3]处理agp30突变体，由于突变体中缺少某种AGPs，其根的表面不像用β-GlcY试剂处理野生型那样出现更严厉的表型。该突变体还表现出对激素ABA和乙烯的敏感性降低，推测AtAGP30 基因可能参与了ABA应答，也有可能作为细胞壁相关激酶信号途径的成员之一参与根表皮细胞早期发育的调控[20,22]。AtAGP31是与AtAGP30同源的非典型AGPs，其在维管组织的韧皮部和初生木质部优势表达[21]，且受胁迫响应因子如茉莉酸甲酯负调控,推测该基因可能参与根的维管组织发育以及非生物胁迫的应激反应。然而，这些AGPs在此生理过程中如何发挥作用还有待进一步验证。AtFLA1 基因在侧根的成熟维管组织以及主根的伸长区中表达,该基因突变导致植株侧根数目增加,根的再生能力减弱，虽然AtFLA1基因功能尚不明确，但有研究证实，该基因家族的其他成员AtFLA11和AtFLA12通过调控根细胞的次生壁结构和成分发挥功能[23]，此外，拟南芥SOS5/FLA4基因编码与细胞黏附相关的FLA蛋白,在盐胁迫下,sos5/fla4突变体的根生长减少，表皮细胞、皮层细胞和内皮层细胞出现异常膨胀，实验证据显示SOS5蛋白可能通过fasciclin结构与细胞壁的其他成分相互作用构成网络，来维持细胞壁的结构和适度的细胞膨胀[22-23]。最近，有研究表明，AtFLA4在拟南芥根组织中表达，并参与了多种遗传功能与信号途径，FLA4包含有GPI锚，其GPI锚可以锚定特定蛋白，GPI锚定的蛋白在GPI专一的磷脂酶或其他酶的作用下，将锚定的蛋白释放于胞外空间从而调控细胞发育[24-25]。

拟南芥reb1-1(rootepidermalbulger)突变体的根生长受到明显抑制，主要表现在伸长区的表皮细胞异常膨胀，而根冠和分生组织细胞发育正常。生理生化研究证实，突变体根组织细胞的细胞壁成分缺少LM2和JIM14识别的AGPs[26]，用β-GlcY处理野生型幼苗导致类似于突变体的表型[27]。我们的研究发现，β-GlcY可以引起生长素运输载体蛋白PIN2的表达模式改变，且胞质中的囊泡运输不能准确定位(未发表资料)。reb1-1编码UDP-D-葡萄糖差向异构酶，该酶具有将D-葡萄糖转换成D-半乳糖的能力，为AGPs蛋白骨架提供半乳聚糖[26]，在培养基中补充10 mmol/L的半乳糖可以恢复突变体的表型和根中AGPs的含量，因此，AGPs在伸长区控制细胞的膨胀是必需的。拟南芥的另一个突变体mur1(murus1)中AGP糖蛋白包含较少的末端岩藻糖残基，导致根的形态和伸长发生改变，从鳗鱼中提取的凝集素能专一结合到AGPs末端岩藻糖残基上，添加该物质可以导致野生型幼苗的根的表型与突变体mur1相似。这进一步说明岩藻糖基化的AGPs在控制根的生长和发育有非常重要的作用[28]。

AGPs作为植物细胞质外体的成分之一，reb1-1突变体根的表皮细胞膨胀表现出异常的微管分布[27]，暗示质膜/细胞壁与细胞骨架之间可能存在某种联系。AGPs插入质膜外部是通过接近微管的GPI锚定部位完成的，从番茄克隆到的一个经典AGPs基因LeAGP-1，该基因GPI锚的缺失表达导致植株矮小,表明GPI锚对于细胞壁与质膜之间连接的重要性[29]。进一步用单克隆抗体和β-GlcY试剂处理拟南芥野生型幼苗，根表皮细胞微管引起快速反应失去正常分布，且伴随着质膜外侧AGPs定位发生改变[27]，同样的方式处理烟草BY-2细胞也表现出类似的结果，反过来，细胞骨架相关药物也影响AGPs的定位[30]，说明了AGPs与细胞骨架元件存在着紧密性连接。最近，有人认为磷脂酶D、细胞壁相关激酶和凝集素受体激酶可能作为潜在因子在质膜某些专一区域如脂筏，充当连接子连接AGPs与细胞骨架来介导信息交流[16,31]。

3 AGPs参与植物-环境微生物互作体系

AGPs除了参与根的形态建成外，还参与了根与环境微生物间的相互作用。这种相互作用多方面的，既可通过与微生物共生有利于植物生长发育，也可以以拮抗的方式导致植物发病[32-33]。

植物在生长过程中，根系能分泌有些特定物质，这些特定物质通过改变其土壤微生态环境从而保持特定微生物种群。豌豆根的分泌物中含能被LM2和JIM13识别，却不能被MAC265识别的AGPs，用蛋白酶和糖苷酶处理后可以抑制根瘤菌的极性黏附[34]，表明根际分泌物的碳水化合物基元和蛋白骨架对根瘤菌的极性吸附是必需的。首先AGPs可能直接通特异的植物凝集素与根瘤菌细胞壁中葡甘聚糖[35]相互作用调控根瘤菌对豆科植物的专一黏附；其次，根部组织细胞释放某些酶如水解木葡聚糖(XTH)、半乳糖苷酶[35]，参与了降解和重塑细胞壁糖蛋白和多糖。AGPs中释放出来的寡糖可以作为诱发因子影响根瘤菌与细胞的信号转导通路[36-37]，一方面可能有助于微生物的吸附，另一方面可能增强植物的防卫反应。

一些非典型AGPs不仅可以诱导土壤微生物在宿主根表面的极性吸附，而且在根瘤结节形成的早期阶段也发挥作用。丛枝真菌黏附到宿主根表面可以诱导宿主根瘤蛋白基因ENOD11的表达，ENOD11是细胞壁中富含脯胺酸的蛋白，它可以改变细胞壁的弹性，有利于根瘤的形成[38-39]。根际共生菌主要通过影响宿主根中的侵入线或者调控侵入线本身的发育，最终导致豆科根瘤的形成。单克隆抗体MAC265免疫定位表明，该抗体识别的嵌合AGPs-AGPE定位于宿主根表面和侵入线部位，而共生缺陷突变体出现异常定位，分布在细胞内的小囊泡中，因此，MAC265抗体识别的AGPs靶向分泌与宿主根中侵入线发育密切相关[40]。

在发病机制方面，很少证据显示根表面的AGPs起作用。然而，HRGPs(hydroxyproline-rich glycoproteins)和伸展蛋白(extensin)已被证实可能参与植物防卫机制，通过对冬瓜抗性和敏感植株在病理条件下HRGPs和AGPs的免疫定位证实，没有感染时，抗性植株比敏感植株更多表达伸展蛋白相关的表面抗原，而感染后，敏感植物的表皮细胞中伸展蛋白相关的表面抗原显著性降低，抗性植株却没有变化，单克隆抗体CCRC-M7识别的AGPs有助于植物的抗性[34]。最近，在土豆根系分泌物的研究中，用黑胫病(Pectobacteriumatrosepticum)获到的诱导子处理土豆根系，LM2和JIM15识别的AGPs表达增强，进一步检测表明AGPs糖基侧链中的Gal含量达68.7%，而JIM13识别的AGPs没有检测到[41]。除了AGPs表达增强外，伸展蛋白的表达和修饰发生了改变[41]。在香蕉中也证实了伸展蛋白和AGPs参与了香蕉枯萎病菌的防卫反应[42]。其他富含赖氨酸的AGPs，如LeAGP-1和NaAGP4也对伤害和病原菌攻击引起反应，NaAGP4在叶片受到灰霉菌感染后表达受到抑制，相反伸展蛋白过表达，使得依赖伸展蛋白的细胞壁产生交联或加强起到防卫作用[41,43]。

4 结语与展望

近几十年来，关于AGPs的研究进展使人们对细胞质外体中这类糖蛋白的生物学功能有了进一步的认识。然而，由于AGPs糖基侧链的高度异质性，不同的糖基修饰赋予蛋白不同的功能，如何理解不同AG 糖基侧链的分子结构和糖基侧链形成与其功能适应是将来研究的巨大挑战。同时这些AG糖基可被糖苷酶水解成各种寡糖残基，这些释放的寡聚糖又是如何作为潜在的因子参与哪些信号通路控制植物的生长发育。此外，AGPs作为植物根际分泌物的成分，相关的研究也表明了AGPs在调控植物根与微生物相互作用过程扮演重要角色，AGPs在多种益生菌与根细胞感染接触处高效表达，它可能作为某种结构成分或者信号分子有助于根细胞与共生体之间的物质交换。但是，AGPs参与这种相互作用的机制是什么？来源于给定物种的AGPs是否只仅仅有效作用于自身的天然微生物天敌？AGPs又是如何精确抑制或刺激微生物群落的成员等这些问题，仍需要我们去回答。这也为AGPs的生物学功能研究开拓了新的研究方向。

未来，随着越来越多的物种全基因组测序完成，通过大数据利用生物信息学的方法，可以有助于我们了解AG糖基化的信息，结合遗传学和分子生物学手段，这将有助于我们解析AGPs糖基化修饰过程中的动力学机制，为进一步阐明AGPs生物学功能奠定基础。