UVB诱导人皮肤成纤维细胞的SMP30基因表达变化

张 杰, 高 波

0 引 言

正常人皮肤成纤维细胞(human skin fibroblast，HSF)长期暴露在氧化应激条件下，可以被氧化应激诱导出现衰老、形态改变、G1期停滞以及许多调控衰老靶基因的表达水平改变等标记[1-2]。紫外线长期照射皮肤可以发生氧化应激类的光损伤，这种光损伤在细胞衰老、皮肤老化的过程中发挥着重要的作用，紫外线中波(ultraviolet B,UVB)作为自然环境中的一种紫外辐射主要作用于皮肤的真皮浅层和表皮层，UVB照射后可以诱导皮肤光老化，导致皮肤变得粗糙、皱纹加深[3]。衰老标记蛋白30(senescence marker protein 30,SMP30)是新发现的一种存在于大脑微粒体中的衰老标记蛋白，最早识别于老鼠肝脏，又被称为钙调素，其表达随着宿主年龄的增加而降低，可能介导延缓衰老的进程[4]。本研究采用不同剂量的UVB照射HSF不同时间，模拟损伤状态，观察HSF细胞生长活性、凋亡率以及SMP30基因表达的变化，探讨该基因在UVB导致的皮肤损伤的作用，为阐明氧化应激类光损伤机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料HSF (武汉大学细胞库)，Reverse Transcription System A3500、Trizol Reagent(Promega)；PE7500(ABI公司)；100 bp DNA marker (Fermentas公司)；SYBR GreenⅠ染料(Gene公司)；RG-BOX紫外凝胶成像系统(Gene公司)； CF-16RX台式高速冷冻离心机(日立公司)；721紫外分光光度计(北京六一公司)；PCR试剂盒 (上海生物工程有限公司)，DMEM培养基(Gibco)。

1.2方法

1.2.1细胞培养与UVB处理将细胞冻融复苏后置于含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，融合生长至80%后用1∶1的胰蛋白酶和EDTA进行消化传代培养。取2～4代生长良好的细胞进行试验，其余液氮保存。设置实验组和对照组，其中经过不同剂量UVB(100、200、300 mJ/cm2)处理不同时间(1、2、3 d后)[5]的HSF为实验组，以未采用UVB照射的HSF为阴性对照组。取生长良好的传代细胞培养24 h后，收集实验组和对照组细胞进行HSF细胞生长活性、凋亡率以及SMP30基因表达的检测。

1.2.2细胞增殖活性的检测应用MTT法检测。具体方法为：取对数生长期的细胞约2×103个(约200 μL)的培养液接种到培养板中，24 h后细胞贴壁单层生长约50%～60%孔面积时弃上清，UVB间距30 cm处照射，剂量分别为100、200、300 mJ/cm2，照射时间分别为1、2、3 d。照射结束后终止培养，弃去上清，每空加二甲亚砜振荡混匀，测定各孔570 nm处吸光度(A)，计算实验组和对照组的细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate, CPIR)。每组实验重复5次，计算公式如下：

CPIR=(对照组A-实验组A/对照组A)×100%

1.2.3流式细胞仪检测HSF细胞凋亡率UVB照射时间、剂量方法同上。照射完毕后胰蛋白酶消化离心收集细胞约1×106个，磷酸盐缓冲液洗涤细胞3次，加入FITC标记的膜联蛋白V 10 μL和结合缓冲液100 μL，室温避光10 min，加入碘化丙啶5 uL，混匀后避光染色30 min后用流式细胞仪测定HSF细胞凋亡率。

1.3SMP30基因表达检测

1.3.1引物合成内参β-actin的上游引物: CTC GCG TAC TCT CTC TTT CTG G，下游引物: GCT TAC ATG TCT CGA TCC CAC TTA A，扩增片段334 bp；SMP30的上游引物:CCG TGG ATG CCT TTG ACT AT，下游引物:TCC AAA GCA GCA TGA AGT TG，扩增片段233 bp(上海生物工程有限公司)。

1.3.2RNA提取与逆转录收集细胞，按照说明书步骤提取HSF细胞中总RNA，提取的RNA经分光光度计测定其纯度和浓度后溶于无RNA酶的双蒸水中，采用A3500逆转试剂盒将提取的RNA逆转录为cDNA，逆转录体系为：总RNA 2 μL，25 mmol/L MgCL24 μL，10 mmol/L dNTP混合液 2 μL，10×Buffer 2 μL，Oligo(dT)引物1 μL，AMV 逆转录酶0.6 μL，Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，用无核酸酶的双蒸水齐体积至20 μL。短暂离心后置于PCR扩增仪，42 ℃ 15 min，95 ℃ 5 min进行逆转录。用无RNA酶的双蒸水稀释逆转的cDNA至100 μL后mRNA扩增或者-80 ℃备用。

1.3.3PCR扩增PCR扩增体系 2mmol/L dNTP 1.5 μL、10×Buffer 3 μL、25mmol/L Mg2+2.4 μL、5 U/uL Taq 0.3 μL、上下游引物各2 μL、10×SYBR-GreenⅠ1 μL、 cDNA 5 μL，用无菌水补齐体积共30 μL。扩增条件：95 ℃ 5 min；94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃ 60 s共40个循环；最后一步收集熔点曲线的过程95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min。

1.3.4结果判断通过熔点曲线判断扩增的特异性，然后取5 μL扩增产物与指示buffer混匀后，2%琼脂糖凝胶进行电泳，120 V电压电泳1 h，紫外凝胶成像系统分析结果。在233、334 bp处出现特异性目的条带。并利用检测Ct值和扩增效率E，以β-actin mRNA为参照，计算SMP30相对表达量，公式如下：

SMP30 mRNA/β-actin mRNA=(1+Eβ-actin)Ct (β-actin)/ (1+ESMP30)Ct (SMP30)

2 结 果

2.1不同剂量UVB处理不同时间后对HSF细胞增殖的影响随着照射时间的延长，CPIR增高，差异有统计学意义(P<0.05)；随着UVB剂量的增加，CPIR增高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

组别不同照射时间的CPIR1d2d3d对照组000实验组 100mJ/cm24.12±0.76*#6.02±1.08#8.38±1.27*# 200mJ/cm27.14±0.84*9.14±1.4411.42±1.51* 300mJ/cm29.52±0.53*#12.37±0.96#14.64±1.05*#与UVB照射2d比较,*P<0.05;与实验组UVB200mJ/cm2比较,#P<0.05

2.2不同剂量UVB处理不同时间后对HSF细胞凋亡的影响随着照射时间的延长，细胞凋亡率逐渐增高，差异有统计学意义(P<0.05)；随着UVB剂量的增加，细胞凋亡率逐渐增高(P<0.05)。见表2 。

组别不同照射时间的细胞凋亡率1d2d3d对照组1.96±0.412.81±0.574.01±0.38实验组 100mJ/cm26.52±1.51*#10.06±1.50#12.06±1.17*# 200mJ/cm29.61±1.14*12.24±1.1914.32±0.86* 300mJ/cm212.06±1.17*#14.18±1.16#16.02±1.32*#与UVB照射2d比较,*P<0.05;与实验组UVB200mJ/cm2比较,#P<0.05

2.3UVB诱导后SMP30基因表达的变化对照组中SMP30基因的相对表达量为(1.15±0.11)，实验组中SMP30基因表达量为(0.66±0.19)，差异有统计学意义(t=9.5，P<0.01)。基因表达的电泳见图1。随着UVB剂量的增加，实验组中SMP30基因表达逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)，并且随着UVB处理时间的延长SMP30基因表达也逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)，基因的表达对UVB诱导有着较为明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性。见表3。

1：对照组；2：β-actin；3～5分别为实验组UVB 100、200、300 mJ/cm2图1 SMP30基因在实验组和对照组中的表达电泳图

组别不同照射时间的基因相对表达量1d2d3d对照组1.08±0.101.18±0.101.20±0.10实验组 100mJ/cm20.94±0.08#*0.82±0.08#0.69±0.10#* 200mJ/cm20.80±0.11*0.66±0.080.53±0.09* 300mJ/cm20.63±0.12#*0.48±0.08#0.36±0.07*#与UVB照射2d比较,*P<0.05;与实验组UVB200mJ/cm2比较,#P<0.05

3 讨 论

衰老是指在正常生理情况下发育成熟的个体随着年龄的增长器官逐渐退行性改变以及生理机能逐渐衰退等生物现象，是内源性因素和外源性因素共同作用的结果[6]。细胞内mRNA含量降低是衰老后细胞分子水平的主要改变，作为人体最大器官的皮肤随着年龄增长也会出现衰老情况，并且研究表明长期的UVB照射可以导致不可逆的慢性光老化晒伤，发病隐蔽、病程较长，不仅可以造成皮肤的早衰、难治性皮损，还可以诱发皮肤肿瘤的发生[7-10]。为研究UVB照射和SMP30基因改变之间的关系，本文以不同剂量UVB处理不同时间后的HSF为研究对象，研究SMP30基因在模拟损伤状态前后基因表达的变化，探讨UVB照射在皮肤衰老中的机制。

本研究发现，随着UVB剂量的增加以及照射时间的延长，HSF细胞增殖抑制率及细胞凋亡率逐渐增高，表明HSF在一定剂量UVB照射一定时间后会出现一定的损伤状态，比如细胞凋亡、细胞生存率下降等。王懿娜等[2]研究也发现300 mJ/cm2剂量的UVB照射可以使得HSF细胞进入光损伤状态，细胞会出现一系列的氧化应激损伤表现，如：细胞周期停滞在G1期、细胞凋亡、SOD活性下降以及氧化应激损伤产物升高等。并且本研究发现随着UVB剂量的增加实验组中SMP30基因表达逐渐降低，基因的表达对UVB诱导有着较为明显的时间依赖性和浓度剂量依赖性，模拟损伤后的基因表达要明显低于对照组，这与国内的研究结果一致[11]。SMP30在实验老鼠中，随着氧化应激水平的逐渐增强，其表达逐渐减弱[12]，并且高表达的SMP30可以抑制与衰老相关的细胞活性氧ROS和β-半乳糖苷酶的表达[11]，而在小鼠敲除SMP30基因后，促氧化剂水平随着鼠龄增加而增加[13]，这些研究表明SMP30具有抗细胞衰老的作用，可能正是由于皮肤在遭受UVB这类氧化应激时，氧自由基增多聚集，并且引起HSF细胞中调控皮肤衰老的基因SMP30表达降低，产生一系列不可逆的细胞内的氧化损伤，导致皮肤的衰老[14]。

研究表明，大剂量的紫外照射可以引起DNA不可逆的损伤，或者细胞坏死甚至癌变，小剂量的照射可以诱导氧化应激的光损伤，进而启动细胞老化过程[15-16]。氧化应激损伤在皮肤细胞早衰过程中发挥着重要作用，并且紫外照射导致的光老化被认为是一种癌前病变[17]，如何有效降低和控制这类损伤，延缓和预防由于氧化应激导致的皮肤衰老是我们后期研究的主要方向，也是课题目前不足之处，但这也为美容医学提供了一个很好的契机。并且进一步研究UVB照射，预防皮肤肿瘤的发生也将是我们后期研究的重点。

综上所述，经过不同剂量UVB处理不同时间后，HSF细胞中SMP30表达存在较为明显的时间依赖性和剂量依赖性，这对了解UVB如何调控皮肤衰老机制提供一定理论依据。

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